Resumen

Una epidemia generalizada de infección por el virus Zika (ZIKAV) se informó en 2015 en América del Sur y Central y el Caribe. Una preocupación importante asociada con esta infección es el aparente aumento de la incidencia de microcefalia en los fetos nacidos de madres infectadas con ZIKAV. En este informe se describe el caso de una embarazada que tuvo una enfermedad febril con exantema al final del primer trimestre del embarazo, mientras que estaba viviendo en Brasil.

La ecografía realizada a las 29 semanas de gestación reveló microcefalia con calcificaciones en el cerebro del feto y la placenta. Después de que la madre solicitó la interrupción del embarazo, se realizó una autopsia del feto. Se observó microcefalia (un cerebro anormalmente pequeño), con agiria casi completa, hidrocefalia y calcificaciones distróficas multifocales en la corteza y la sustancia blanca subcortical, con desplazamiento cortical asociado e inflamación focal leve.

El ZIKAV se halló en el tejido cerebral fetal mediante reacción en cadena de la polimerasa-transcriptasa reversa (PCR-TR), con resultados consistentes en la microscopia electrónica. Se recuperó el genoma completo del ZIKAV del cerebro fetal.

ZIKAV, un flavivirus emergente transmitido por mosquitos, fue inicialmente aislado de un mono rhesus en el bosque Zika en Uganda en 1947. Es transmitido por varias especies de mosquitos Aedes. Después de la primera infección humana por ZIKAV, se notificaron casos esporádicos en el sudeste de Asia y al sur del Sahara en África. ZIKAV fue responsable del brote en la isla de Yap de Micronesia en 2007 y de las grandes epidemias en la Polinesia Francesa, Nueva Caledonia, las Islas Cook, y la Isla de Pascua en 2013 y 2014.

En 2015, hubo un aumento dramático de los reportes de infección por ZIKAV en las Américas. Brasil es el país más afectado, con estimaciones preliminares de 440.000 a 1.3 millones de casos de infección por ZIKAV autóctono reportados a diciembre del 2015.

El cuadro clínico clásico de la infección por ZIKAV se asemeja al de la fiebre del dengue y del Chikungunya y se manifiesta por fiebre, cefalea, artralgia, mialgia y erupción maculopapular, un complejo de síntomas que dificulta el diagnóstico diferencial. Aunque la enfermedad es autolimitada, se describieron casos de manifestaciones neurológicas y síndrome de Guillain-Barré en la Polinesia Francesa y en Brasil durante las epidemias de ZIKAV.

Informes recientes del Ministerio de Salud de Brasil sugieren que los casos de microcefalia se han incrementado en un factor de aproximadamente 20 entre los recién nacidos en la región noreste del país, lo que indica una posible asociación entre la infección por ZIKAV durante el embarazo y las malformaciones fetales. Se presenta un caso de transmisión vertical de ZIKAV en una mujer que probablemente fue infectada por el virus en el noreste de Brasil al final del primer trimestre del embarazo. 

Reporte de caso

A mediados de octubre de 2015, una mujer europea de 25 años de edad previamente sana llegó al Departamento de Perinatología del Centro Médico Universitario de Ljubljana, Eslovenia, debido a supuestas anomalías en el feto. Desde diciembre de 2013, ella había vivido y trabajado como voluntaria en Natal, la capital del estado de Rio Grande do Norte. Ella había quedado embarazada a finales del mes de febrero de 2015.

Durante la semana 13 de la gestación, había comenzado a sentirse enferma con fiebre alta, seguida de dolor musculoesquelético y retro ocular, rash maculopapular y prurito. Dado que hubo una epidemia de ZIKAV en la comunidad, se sospechó de infección por el virus, pero no se llevó a cabo la prueba de diagnóstico virológico. Las ecografías realizadas a las 14 y 20 semanas de gestación mostraron crecimiento y anatomía del feto normales.

La paciente regresó a Europa a las 28 semanas de gestación. El examen ecográfico que se realizó a las 29 semanas de gestación mostró los primeros signos de anomalías fetales, y la mujer fue derivada al Departamento de Perinatología. Al mismo tiempo, ella también notó la disminución de los movimientos fetales.

La ecografía que se realizó a las 32 semanas de  gestación confirmó el retraso del crecimiento intrauterino (estimado en un percentilo 3 de peso fetal) con líquido amniótico normal, una medición de la placenta de 3,5 cm de espesor (tamaño normal) con numerosas calcificaciones, una circunferencia craneana debajo del segundo percentilo para la edad gestacional (microcefalia), ventrículomegalia moderada, y un diámetro trans-cerebelar por debajo del percentilo dos. Las estructuras cerebrales eran borrosas, y había numerosas calcificaciones en varias partes del cerebro. No hubo ninguna otra anomalía estructural fetal obvia. Los flujos sanguíneos fetal, umbilical, y uterino eran normales en la ecografía Doppler.

La presentación clínica levantó la sospecha de infección viral fetal. Debido a la enfermedad cerebral grave y a la microcefalia, se consideró que el feto tenía mal pronóstico con respecto a su salud neonatal. La madre solicitó la interrupción del embarazo, y el procedimiento fue aprobado posteriormente por los comités de ética hospitalarios y nacionales. La interrupción médica del embarazo se llevó a cabo a las 32 semanas de gestación.

Durante el procedimiento, la única anomalía morfológica evidente fue la microcefalia prominente. La consulta con genética que incluyó una historia familiar materna detallada no reveló ninguna sospecha de enfermedades o síndromes genéticos. Se realizó una autopsia, como es obligatorio en todos los casos de interrupción del embarazo. La madre dio su consentimiento informado por escrito para la publicación de este caso clínico.

Métodos

Autopsia y examen del Sistema Nervioso Central (SNC) 
Se llevó a cabo una autopsia del feto y de la placenta 3 días después de la interrupción del embarazo, con un amplio muestreo de todos los órganos, la placenta, y el cordón umbilical. Las muestras se fijaron en formalina tamponada al 10% y se embebieron en parafina. Se recogieron muestras de tejido fresco para investigaciones microbiológicas.

El cerebro y la médula espinal se fijaron en formalina tamponada al 27% durante 3 semanas, después de lo cual se llevó a cabo un examen neuropatológico con un amplio muestreo del cerebro y la médula espinal. Las secciones de todas las muestras de tejido fueron teñidas con hematoxilina y eosina. Se realizó inmunotinción para proteína ácida fibrilar glial, neurofilamentos, antígeno DR de leucocitos (HLA-DR), CD3 (para resaltar las células T), y CD20 (para resaltar las células B) en muestras representativas del SNC.

Microscopia electrónica
El tejido se recogió a partir de muestras de cerebro fijadas con formalina y se sometió a fijación en tetróxido de osmio al 1% y a deshidratación con concentraciones crecientes de etanol. La muestra fue entonces embebida en Epon. Se hicieron secciones semifinas (1,4 µm), se tiñeron con Azur II, y se analizaron por medio de microscopía de luz. Los cortes ultrafinos (60 nm) se tiñeron con acetato de uranilo y citrato de plomo.

Además, un pequeño trozo de cerebro (5 mm3) fue homogeneizado en buffer. La suspensión fue entonces aclarada por centrifugación a baja velocidad, y el sobrenadante obtenido se ultracentrifugó directamente en una rejilla de microscopio electrónico con el uso de un Airfuge (Coulter Beckman). La tinción negativa se realizó con ácido fosfotúngstico al 1%. La obtención de imágenes de los cortes ultrafinos y del homogeneizado de cerebro se realizó con el uso de un microscopio de transmisión electrónica JEM-1400Plus de 120 kV (JEOL).

Inmunofluorescencia indirecta
Las secciones embebidas en parafina del tejido cerebral fetal y el tejido cerebral de un hombre sometido a autopsia previa como control negativo se incubaron con suero obtenido de la madre del feto (dilución, 1:10), y luego con anticuerpos IgG antihumanos marcados con isotiocianato de fluoresceína (ITF, dilución 1:50). Además, el tejido cerebral fetal se incubó con el suero obtenido de un donante de sangre saludable, así como con anticuerpos IgG antihumanos marcados con ITF solamente.

Investigación microbiológica
Se extrajo ARN a partir de 10 mg de placenta, pulmones, corazón, piel, bazo, timo, hígado, riñones, y corteza cerebral con el uso del kit de purificación de ARN TRIzol Plus (Thermo Fisher Scientific). La PCR-TR en tiempo real para la detección del ARN del ZIKAV (NS5) y la PCR-TR de un solo paso para la detección de la región de codificación de la envoltura proteica (360 bp) se realizaron como se describió previamente.

Además, se llevó a cabo la secuenciación de nueva generación en muestras de tejido cerebral fetal con el uso del Ion Torrent (Thermo Fisher Scientific) y el software Geneious, versión 9.0.6. Las lecturas de ambas corridas se combinaron y se mapearon con la secuencia de referencia (ZIKAV MR766; LC002520) utilizando medidas predeterminadas. Para el análisis filogenético, se utilizaron secuencias del genoma completo del ZIKAV, y se realizaron múltiples alineamientos de secuencias (ClustalW).

Se construyó un árbol filogenético (modelo GTR+G+I) utilizando el sistema de software MEGA6 para mostrar las relaciones filogenéticas.

La secuencia de nucleótidos del ZIKAV que se obtuvo en este estudio fue depositada en  GenBank bajo el número de acceso KU527068. Se proporciona una descripción detallada de los métodos moleculares en el anexo complementario, disponible con el texto completo de este artículo en NEJM.org. Los resultados de los análisis serológicos integrales del suero materno y una descripción de los procedimientos diagnósticos moleculares diferenciales realizados en las muestras de tejido fetal se proporcionan en el anexo complementario. Todos los autores dan fe de la integridad y exactitud de los datos y análisis presentados.

Resultados

Autopsia y resultados neuropatológicos

El peso corporal fetal fue de 1.470 g (percentilo 5), la longitud de 42 cm (percentilo 10), y la circunferencia craneana de 26 cm (percentilo 1). La única anomalía externa observada fue la microcefalia. La placenta pesaba 200 g, resultando en una relación peso placentario-fetal de 0,136 (< percentilo 3).

El examen macroscópico del SNC reveló microencefalia con un peso cerebral total de 84 g (4 DE por debajo de la media), cisuras de Silvio ampliamente abiertas, y cerebelo y tronco encefálico pequeños. Se observó agiria casi completa e hidrocefalia interna de los ventrículos laterales. Hubo numerosas calcificaciones de tamaño variable en la corteza y en la sustancia blanca subcortical en los lóbulos frontal, parietal, y occipital. Los núcleos subcorticales estaban bastante bien desarrollados. A pesar de algunas autolisis, el examen microscópico reveló una arquitectura celular apropiada del cerebro fetal.

Las características histopatológicas más prominentes fueron las colecciones multifocales de calcificaciones filamentosas, granulares, y con forma de neuronas en la corteza y la sustancia blanca subcortical con compromiso focal de toda la cinta cortical, ocasionalmente asociado con desplazamiento cortical. Se constató la presencia de astrogliosis difusa con estallido focal de astrocitos en el espacio subaracnoideo, sobre todo en la convexidad de los hemisferios cerebrales. Células microgliales activadas y algunos macrófagos con expresión de HLA-DR estaban presentes en la mayor parte de la sustancia blanca y gris cerebral. Se observaron leves infiltrados perivasculares  dispersos compuestos por células T y algunas células B en la sustancia blanca subcortical. El cerebelo, el tronco encefálico y la médula espinal no mostraron ni inflamación ni calcificaciones distróficas.

El tronco cerebral y la médula espinal mostraron degeneración walleriana de los tractos descendentes largos, especialmente del tracto corticoespinal lateral, mientras que las columnas dorsales ascendentes estaban bien conservadas. La inmunofluorescencia indirecta reveló una reacción intracitoplasmática granular en las estructuras neuronales destruidas, apuntando a una posible ubicación del virus en las neuronas. El examen histológico de la placenta confirmó la presencia de calcificaciones focales en vellosidades y decidua, pero no inflamación. No hubo cambios patológicos relevantes en otros órganos fetales o en el cordón umbilical o membranas fetales. El cariotipo fetal con el uso de tecnología de microarray mostró un perfil 46XY normal (masculino).

Microscopia electrónica
Aunque el análisis de las secciones ultrafinas del cerebro mostró un tejido cerebral pobremente conservado con células rotas y lisadas, se hallaron grupos de partículas densas similares a virus de aproximadamente 50 nm en las vesículas citoplasmáticas dañadas. También se detectaron grupos de estructuras envueltas con un interior luminoso. En la periferia de tales grupos, podían observarse restos de membranas. La tinción negativa del homogeneizado de cerebro reveló partículas de virus esféricos de 42 a 54 nm con características morfológicas en consonancia con los virus de la familia Flaviviridae.

Investigación microbiológica
Se obtuvieron resultados positivos para ZIKAV por PCR-TR sólo de la muestra de cerebro fetal, donde se detectaron 6,5×107 copias de ARN viral por miligramo de tejido. Además, se evaluaron todas las muestras de autopsia por PCR y se halló que eran negativas para otros flavivirus (virus del dengue, virus de la fiebre amarilla, virus del Nilo Occidental, y de la encefalitis trasmitida por garrapatas), junto con el virus Chikungunya, virus de la coriomeningitis linfocítica, citomegalovirus, virus de la rubéola, virus varicela-zoster, virus herpes simplex, parvovirus B19, enterovirus, y Toxoplasma gondii.

Se recuperó una secuencia completa del genoma ZIKAV (10.808 nucleótidos) a partir del tejido cerebral. El análisis filogenético mostró la mayor identidad (99,7%) con la cepa ZIKAV aislada de un paciente de la Polinesia Francesa en 2013 (KJ776791) y con el ZIKAV detectado en San Pablo, Brasil, en 2015 (KU321639), seguido de una cepa aislada en Camboya en 2010 (JN860885, con identidad del 98,3%) y con una cepa del brote de Micronesia en 2007 (EU545988, 98% de identidad). En la poliproteína del ZIKAV, se detectaron 23 polimorfismos en comparación con la cepa de Micronesia y 5 polimorfismos en comparación con la cepa de la Polinesia Francesa; se encontraron tres cambios de aminoácido en la región NS1 (K940E, T1027A, y M1143V), uno en la región NS4B (T2509I), y uno en la región metiltransferasa tipo FtsJ (M2634V).

Discusión

Este caso muestra una lesión cerebral fetal grave asociada con la infección por ZIKAV con  transmisión vertical. Recientemente, el ZIKAV se halló en el líquido amniótico de dos fetos que tenían microcefalia, lo que es consistente con la transmisión intrauterina del virus. Los casos descriptos son similares al caso presentado aquí y se caracterizaron por un SNC severamente afectado y un importante retraso del crecimiento intrauterino.

Las calcificaciones en la placenta y la baja relación peso placentario-fetal, observados en este caso, indican un daño potencial a la placenta por el virus. Entre los pocos informes de los efectos teratogénicos de los flavivirus, los investigadores describen al cerebro y los ojos como objetivos principales. No se detectó la presencia de virus ni cambios patológicos en otros órganos fetales además del cerebro, lo que sugiere un fuerte neurotropismo del virus.

La localización de la señal de inmunofluorescencia y la apariencia morfológica de las calcificaciones, que se asemejan a estructuras neuronales destruidas, indican una posible ubicación del virus en las neuronas. El daño consiguiente puede causar detención del desarrollo de la corteza cerebral a la edad embrionaria de aproximadamente 20 semanas. El mecanismo implicado en el neurotropismo del ZIKAV no está claro. La asociación entre infección por ZIKAV y anomalías cerebrales fetales también se destacó por los hallazgos en la microscopía electrónica que fueron consistentes con la detección de ZIKAV en el cerebro fetal.

Se observaron partículas densas consistentes con ZIKAV en el retículo endoplásmico dañado. Grupos de estructuras envueltas con un interior brillante, similares a restos de complejos de replicación característicos de los flavivirus, indican replicación viral en el cerebro.

Los hallazgos en la microscopía electrónica sugieren una posible persistencia del ZIKAV en el cerebro del feto, posiblemente debido a que es un medio inmunológicamente seguro para el virus. Los números de copias virales que se detectaron en el cerebro del feto fueron sustancialmente superiores a los reportados en el suero obtenido de pacientes adultos infectados por el ZIKAV pero similares a los reportados en muestras de semen.

La secuencia completa del genoma del ZIKAV recuperada en este estudio es consistente con la observación de que la cepa presente en Brasil ha surgido del linaje asiático. La presencia de dos grandes sustituciones de aminoácidos posicionados en las proteínas no estructurales NS1 y NS4B probablemente representa un acontecimiento accidental o indica un proceso de eventual adaptación del virus a un nuevo entorno.

Es necesaria investigación adicional para entender mejor las implicaciones potenciales de estas observaciones. Es probable que la rápida propagación del ZIKAV por todo el mundo sea un fuerte impulso para la investigación colaborativa en las propiedades biológicas del virus, particularmente porque el riesgo de infecciones virales neurotrópicas y teratogénicas provocan una alta carga emocional y económica para la sociedad.

Comentario

El Zika es un virus que ha cobrado notoriedad en el último tiempo debido a su rápida propagación mundial. Si bien en general es una enfermedad autolimitada, el principal motivo de preocupación con respecto su diseminación es la posibilidad de transmisión vertical y de desarrollo de microcefalia en el feto en gestación. Informes recientes sobre el incremento de los casos de microcefalia entre los recién nacidos en Brasil, indican una posible asociación entre la infección por ZIKAV durante el embarazo y las malformaciones fetales observadas, avalada por hallazgos fisiopatológicos e histológicos. Se requiere más y nueva investigación sobre las características de este virus, a fin de promover políticas sanitarias efectivas que ayuden a la prevención y tratamiento de esta infección emergente. 

Resumen y comentario objetivo: Dra. María Eugenia Noguerol