La incontinencia fecal (IF) es una condición debilitante frecuente que afecta aproximadamente al 8 – 11% de la población [1]. Las opciones de tratamiento inicial incluyen la modificación de la actividad intestinal con dieta, medicación antidiarreica y técnicas de biofeedback. Cuando son insuficientes, debe considerarse la cirugía. La reparación del esfínter es posible para las roturas esfinterianas limitadas, pero los resultados se deterioran con el paso del tiempo, con tasas de fracaso de hasta el 72% dentro de los 5 años [2-4].

La inyección de agentes abultadores ha resultado en tasas de éxito variables [5-7]. La estimulación del nervio sacro (ENS) se ha convertido en el procedimiento quirúrgico de primera línea a causa de su buena tolerancia y tasa de éxito a largo plazo del 60% [8]. No obstante, requiere cambio regular del marcapaso (aproximadamente cada 5 años) y sigue siendo costoso a largo plazo [9,10].

En caso de fracaso de la ENS, la sustitución del esfínter (implante de esfínter intestinal artificial o graciloplastia estimulada) es la única alternativa a la ostomía. Sin embargo, ese procedimiento quirúrgico es invasivo, con alta morbilidad, tasas de éxito variables con deterioro de su efectividad con el paso del tiempo, y no está disponible en algunos países [9].

Se han introducido otros abordajes, tales como la inyección de agentes abultadores en el complejo esfinteriano anal, pero brindan resultados inconsistentes [7]; su rol en el algoritmo del tratamiento de la IF queda por confirmar. De la misma manera, la radiofrecuencia (procedimiento SECCA) ha sido abandonada en muchos centros [11] y el esfínter anal magnético está siendo aún evaluado [12,13].

Como resultado, las terapias actuales para la IF siguen siendo dramáticamente insuficientes para cubrir las necesidades terapéuticas, y la colostomía permanente es requerida aún para algunos pacientes.

Las células madre adultas tienen el potencial para brindar la curación definitiva de la enfermedad mediante la regeneración del tejido lesionado. La terapia celular utilizando mioblastos es posible, porque esas células pueden ser obtenidas de biopsias musculares y expandidas en cultivos bajo condiciones de grado clínico.

Su inyección dentro del músculo dañado ha mostrado una excelente tolerancia, como se evidenció desde los primeros ensayos clínicos en pacientes con distrofia muscular [14,15], o insuficiencia cardíaca [16,17]. Los mioblastos autólogos han sido propuestos para el tratamiento de la incontinencia urinaria, con resultados alentadores y pocos efectos colaterales [18,19].

Los autores de este trabajo proporcionaron recientemente un principio de prueba para la terapia con células mioblásticas de la IF en un modelo con ratas, en el que la inyección de mioblastos en el esfínter anal resultó en la restauración de la presiones esfinterianas [20]. Un estudio piloto clínico abierto [21,22] reportó una mejoría sustancial de la continencia y de la calidad de vida en 10 pacientes con IF, evaluados mediante los puntajes Cleveland Clinic Incontinence (CCI) y Faecal Incontinencia Quality of Life (FIQL), respectivamente.

No obstante, el efecto de los mioblastos en el tratamiento de la IF no ha sido evaluado aún en un estudio controlado. En consecuencia, los autores de este trabajo investigaron la seguridad y eficacia de las inyecciones intraesfintéricas de mioblastos autólogos (MA) en pacientes con IF severa e insuficiencia esfinteriana.

> Diseño del estudio

Se trató de un ensayo prospectivo, randomizado, doble ciego, controlado con placebo, que fue registrado en ClinicalTrial.gov (NCT01523522).

> Pacientes

Desde marzo de 2012 hasta junio de 2014, 24 pacientes con IF fueron enrolados. Los criterios de inclusión fueron: edad de 20 a 65 años; IF severa por al menos 3 meses, definida como un puntaje CCI [23] de 10 o mayor [rango (0, normal – 20, el más severo)]; IF debida a deficiencia esfinteriana [defecto único, disrupción múltiple o degeneración del esfínter anal externo (EAE) diagnosticada por endosonografía]; y refractariedad al tratamiento conservador, esto es, tratamiento médico y biofeedback.

Las criterios de exclusión fueron lesión del EAE > 30% de la circunferencia; miopatía; diabetes descompensada; enfermedad inflamatoria intestinal; e inhabilidad para comprehender el cuestionario preoperatorio.

Antes del enrolamiento, todos los pacientes tuvieron evaluación clínica, manometría anorrectal, ultrasonografía endoanal, pruebas electrofisiológicas perineales y defeco-resonancia magnética nuclear (RMN). Después de haber dado el consentimiento informado por escrito, todos los pacientes completaron el formulario CCI [23] y la versión francesa del cuestionario FIQL [24,25].

El protocolo fue aprobado por el Haute-Normandie Ethics Committee (Francia) y autorizado por la autoridad competente. La completitud del estudio fue revisada periódicamente por un comité independiente de expertos (1 metodologista, 1 cirujano digestivo, 1 experto en terapia celular); ese comité tuvo acceso a todos los datos, dio consejos sobre la imputabilidad de los efectos adversos, y autorizó la inyección posterior de MA para el grupo placebo.

El objetivo final primario fue la disminución del puntaje CCI entre el inicial y a los 6 meses de la inyección en el grupo de MA y en el grupo de placebo. Los objetivos finales secundarios fueron: variaciones en el puntaje CCI a los 12 meses en relación con el puntaje basal; tasa de respuesta (= 30% de reducción en puntajes CCI) a los 6 y 12 meses, según lo recomendado [26,27]; variación a los 6 y 12 meses del puntaje FIQL, manometría anorrectal y datos ultrasonográficos, en relación con los basales.

> Randomización y cegamiento

La randomización fue realizada utilizando sobres que fueron preparados y secuencialmente numerados por el Departamento de Bioestadística del centro asistencial terciario en donde se desempeñan los autores, y luego comunicada al sector de bioterapia del mismo centro, en la última etapa de la producción de mioblastos para la preparación de la jeringa. Los pacientes y el cirujano permanecieron inconscientes del contenido de la jeringa hasta al menos la evaluación a los 6 meses del objetivo final primario.

> Procedimiento para la preparación de los mioblastos

Para todos los pacientes, se realizó una biopsia del cuádriceps (0,5 a 1,5 g) bajo anestesia local, y la muestra resultante fue inmediatamente transferida al sector de bioterapia. El fragmento del músculo fue picado y digerido enzimáticamente con colagenasa NB6 (Serva electroforesis, Heidelberg, Alemania). Luego se cultivaron las células aisladas en un medio de selección de mioblastos, conteniendo 10% de suero fetal de ternera de grado clínico (Invitrogen, Carlsbad, CA), por 3 semanas aproximadamente.

Los mioblastos fueron luego amplificados por aproximadamente 1 semana, en un medio de expansión conteniendo 10% de suero fetal de ternera y 10 ng/mL de factor básico de crecimiento de fibroblastos (R&D Systems, Minneapolis, MN). En esa etapa, el centro de bioterapia fue informado de los datos de la randomización por el Departamento de Bioestadísticas.

El producto para la terapia celular consistió en células recogidas en el tercer pasaje (P3). Los criterios durante el proceso y/o finales, para la liberación, incluyeron el número de células, viabilidad celular, porcentaje de células CD56⁺ específicas de los mioblastos, y esterilidad y ausencia de endotoxinas.

Para la rama con MA, las células fueron condicionadas en 8 jeringas de 12,5 ± 2,5 x 10⁶ células, en albúmina humana 1,6% (VIALBEX, LFB, Les Ulis, Francia) y solución salina. Para la rama con placebo, las jeringas fueron llenadas con solución salina suplementada con albúmina humana 1,6%, mientras que las células obtenidas en P3 fueron congeladas en dimetilsulfóxido 6% (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO) y albúmina humana 4%.

> Procedimientos de implante

Los procedimientos de implante fueron realizados en condiciones ambulatorias. Todos los pacientes recibieron preparación rectal con povidona iodada en la mañana de la cirugía. Los pacientes fueron colocados en posición de litotomía y luego se desinfectó el periné y se inyectó subcutáneamente el anestésico local (Lidocaína 1%).

La administración de 100 ± 20 x 10⁶ de MA o placebo fue efectuada por el cirujano investigador principal, como 8 inyecciones en el EAE dentro del musculo residual existente, bajo guía ecográfica endoanal y circunferencialmente.

Los pacientes fueron monitoreados durante 3 horas con evaluación del dolor usando una escala análoga visual. Todos los pacientes recibieron un régimen de 7 días de antibióticos (cefuroxima, metronidazol) y un programa de re-educación mediante biofeedback, 15 días después de la inyección.

> Seguimiento

Las visitas de seguimiento fueron agendadas a los 6 y 12 meses, y consistieron en completar los puntajes CCI y FIQL, manometría anorrectal, pruebas electrofisiológicas perineales, endosonografía y RMN. Las ocurrencias clínicas no deseables de cualquier tipo fueron clasificadas como eventos adversos.

El final del cegamiento tuvo lugar después de registrar los criterios de evaluación a los 6 meses, de manera que se les pudo ofrecer a los pacientes randomizados para placebo la posibilidad de recibir una inyección tardía (después de la visita de los 12 meses) de sus MA. Se requirió la aprobación del comité independiente antes de la inyección.

> Cálculo del tamaño de la muestra

En un estudio piloto de inyección de MA en 10 pacientes con IF, Frudinger y col., reportaron una disminución media del puntaje CCI a los 12 meses, del 13,7, con un desvío estándar de 4,1 (deducido de su intervalo de confianza del 95%), correspondiente a un tamaño del efecto de 3,3 (proporción media de 13,7 disminuida a desvío estándar de 4,1). A los 6 meses, el descenso medio fue también de 13,7 pero no se reportó desvío estándar o intervalo de confianza para esa disminución del puntaje CCI.

Con el fin de evitar el sobreoptimismo de un estudio piloto, loa autores de este trabajo consideraron una diferencia mucho más pequeña entre los grupos de MA y placebo, esto es, un tamaño del efecto de 1,353 (41% de lo reportado por Frudinger y col. [21]).

Por ejemplo, eso podría corresponder a una diferencia en la media de la disminución del puntaje CCI a los 6 meses de 13,7 vs 8,2 en los grupos de MA y placebo, respectivamente, o de 10,0 vs 4,5, en ambos casos con un desvío estándar común aún de 4,1. Para alcanzar un poder estadístico del 80% relacionado con esa diferencia entre los grupos, para un nivel de significación de dos lados de 0,05 con la prueba no paramétrica de Mann-Whitney, el objetivo del tamaño de la muestra fue de 24 pacientes, 12 en cada grupo.

> Análisis estadístico

Para los resultados cuantitativos, el cambio absoluto dentro del grupo desde la línea de base, fue evaluado utilizando la prueba de los rangos con signo de Wilcoxon. Las diferencias entre los grupos fueron evaluadas mediante la prueba no paramétrica de Mann-Whitney. La mediana y rango son reportados a menos que se señale otra cosa. Los conteos y porcentajes son reportados para los datos categóricos.

Para todas las pruebas estadísticas, un valor de 2 lados de P menor de 0,05 fue considerado significativo. Los análisis estadísticos fueron realizados con el programa SAS (versión 9.3; SAS Institute, Cary, NC).

> Datos basales

Globalmente, 24 mujeres con una mediana para la edad de 52 años (rango: 24-64) fueron asignadas al azar para recibir inyecciones de MA o de placebo. La mediana de su índice de masa corporal fue de 24,2 kg/m² (rango: 17,2 a 31,5). Ocho pacientes tenían antecedentes previos de cirugía para la IF, incluyendo reparación del esfínter (n = 3), ENS (n = 4), y rectopexia (n =1).

Todas las 24 pacientes tenían insuficiencia del EAE, de las que 24 habían tenido rotura < 30%, objetivada por ecografía endoanal. Además, 9 pacientes tenían también un defecto en el esfínter anal interno. No hubo diferencias apreciables en las características basales entre los 2 grupos de tratamiento, excepto tal vez para el componente 1 del FIQL. Notablemente, el puntaje CCI y los hallazgos fisiológicos no fueron diferentes entre los grupos.

> Preparación de los mioblastos

Los mioblastos fueron preparados de una biopsia muscular después de 3 a 4 semanas de cultivo. Las preparaciones celulares fueron CD90⁺, antígeno leucocitario humano (HLA) clase 1⁺, CD45^–, CD34^–, y CD133^–, conteniendo una frecuencia similar (± desvío estándar) de 55 ± 7%, y 46 ± 7% de células CD56⁺ (diferencia no significativa) para las ramas de MA y de placebo, respectivamente. Su tiempo de duplicación promedio fue de 28 horas, las células sembradas dieron lugar a colonias [rango 3% a 45% de unidades de formación de colonia (UFC) y el potencial miogénico se evidenció en la mayoría de las muestras.

Las preparaciones celulares expresaron transcripciones de ARNm de marcadores moleculares típicos de células miogénicas, tales como desmina, MRF4, Myf5, MyoD, y Pax7. Como se esperaba, se evidenciaron algunas anomalías genómicas no recurrentes relacionadas con el proceso de cultivo celular, con el análisis de cariotipo y FISH, pero no se asociaron con un riesgo de transformación, de acuerdo con el reporte previo de los autores [28]. Notablemente, todas las preparaciones celulares perdieron la positividad CD56 después de varios pasajes y siempre se volvieron senescentes. No creció telomerasa reexpresada en el agar blando.

> Efecto sobre el puntaje CCI

La inyección de 100 ± x 10⁶ MA o placebo fue realizada como 8 inyecciones directamente en el EAE bajo guía ecográfica endoanal. En la visita post inyección a los 6 meses, la mediana del puntaje CCI disminuyó significativamente desde la línea de base, tanto en el grupo de MA (9 vs 15, P = 0,02) como en el grupo placebo (10 vs 15, P = 0,01).

Debido a ese importante pero no anticipado efecto del placebo, la mejora en el puntaje CCI en el grupo de MA, no fue estadísticamente diferente de la observada en el grupo control. De hecho, 6 de 12 pacientes (50%) que habían recibido placebo, respondieron satisfactoriamente (reducción del 30% o más en el puntaje CCI) a los 6 meses, comparado con 5 de 12 pacientes (41,7%) que habían recibido MA.

A los 12 meses, la mediana del puntaje CCI continuó mejorando significativamente en  el grupo de MA (6,5 vs 15, P = 0,006), en marcado contraste con el grupo control, en donde se perdió el efecto del placebo (14 vs 15, P = 0,35). Consecuentemente, la tasa de respuesta a los 12 meses fue significativamente mayor en la rama de MA que en la rama de placebo (58% vs 8%, P = 0,03).

> Efecto sobre los objetivos finales secundarios

El análisis de los objetivos finales secundarios reveló una falta de mejoría en los puntajes FIQL en la rama de placebo, tanto en la evaluación a los 6 como a los 12 meses. En contraste, los componentes 1 (estilo de vida) y 2 (estilo de vida, afrontamiento/comportamiento) del FIQL mejoraron significativamente en la rama de MA a los 6 y 12 meses, respectivamente.

Ninguna de las evaluaciones electrofisiológicas anorrectales mostró diferencias significativas en relación con la línea de base en la rama de MA, mientras que la presión esfinteriana en reposo se deterioró a los 12 meses en la rama de placebo. Similarmente, no se evidenció cambios en la endosonografía, pruebas electrofisiológicas, o RMN, en ambas ramas.

> Inyección tardía de MA en los pacientes de la rama placebo

Después de la evaluación a los 12 meses de los objetivos finales, se les propuso a las 12 pacientes que fueron randomizadas para la rama placebo, la inyección de sus MA congelados, después de la aprobación del comité independiente de expertos, De ellas, 11 pacientes aceptaron la terapia tardía, que resultó en una tasa de respuesta del 60% (6/10) a los 12 meses, comparado con los datos basales, en las pacientes evaluables.

> Efectos adversos

Todos los parámetros postoperatorios, hematológicos y bioquímicos, fueron normales. Se reportaron tres efectos adversos, que fueron imputados al tratamiento. Ninguno fue considerado como grave y todos fueron resueltos. Consistieron en dolor transitorio (n = 2), e infección cutánea (n = 1), en el sitio de la biopsia, resolviéndose esta última sin antibióticos.

Un resultado inesperado del presente estudio fue la importancia del efecto placebo observado a los 6 meses

Este es el primer ensayo randomizado controlado con placebo evaluando la eficacia y seguridad de las inyecciones de MA para el tratamiento de la IF. La inyección de mioblastos resultó en una reducción significativa de los puntajes CCI y una mejora en la calidad de vida. En efecto, entre los pacientes en la rama de MA, el puntaje CCI a los 6 y 12 meses disminuyó desde una mediana de 15 a nivel basal, a 9 y 6,5, respectivamente.

El análisis de la tasa de respuesta a los 12 meses mostró una reducción >30% en el puntaje CCI en el 58% de las pacientes en la rama de MA, comparado un 8% en la rama de placebo. Para las 7 pacientes que respondieron en la rama de MA, su puntaje CCI cayó dramáticamente desde una mediana de 12 a 5, a los 6 y 12 meses, respectivamente, posteriores a la terapia celular. Estos resultados concuerdan con los de Romaniszyn y col. [29], que reportaron una tasa de respuesta del 67% a los 12 meses de seguimiento alejado en 9 pacientes, en un estudio piloto abierto.

Una tasa de respuesta aún mayor, del 100%, fue reportada en otro estudio abierto por Frudinger y col. [21], quienes están efectuando en la actualidad un ensayo clínico controlado con placebo para esta indicación (www.clinicaltrialsregister.eu, 2010-021463-32). Sin embargo, en contraste con el último estudio, los autores del presente trabajo observaron claramente un grupo de pacientes que no respondió a los 12 meses, en el que el puntaje CCI permaneció en el mismo rango que antes del tratamiento.

Un resultado inesperado del presente estudio fue la importancia del efecto placebo observado a los 6 meses. Como consecuencia de ello, el estudio falló en demostrar la superioridad de las inyecciones de mioblastos sobre el placebo a los 6 meses. Sin embargo, la disminución de la mediana del puntaje CCI fue sólo transitoria en la rama de placebo, y los puntajes CCI retornaron a los niveles pre tratamiento a los 12 meses, en marcado contraste con la rama de MA.

En ese contexto, los autores creen que los ensayos clínicos futuros deberían considerar un objetivo final primario a 1 año en lugar de 6 meses. Muchos ensayos randomizados sobre el tratamiento de la IF han evidenciado la efectividad de la intervención per se en la IF [27,30,31].

No obstante, el efecto placebo observado en el presente estudio fue más pronunciado que el reportado en esos trabajos y queda por determinar si se debió sólo al efecto abultador de la inyección de solución salina más albúmina, o a su asociación con el biofeedback. La última hipótesis parece ser improbable, dado que ningún paciente había respondido al biofeedback antes de su inclusión en este estudio.

Entre los pacientes evaluables de la rama placebo que recibieron una inyección tardía, 6 de 10 respondieron a los 12 meses después de haber recibido los MA. Entre ellos, 5 de 6 pacientes habían respondido inicialmente al placebo a los 6 meses, pero sólo 1 de 6 a los 12 meses. No se encontró correlación entre la respuesta al placebo a los 6 meses y la respuesta a la inyección tardía de MA a los 6 meses.

De manera importante: la eficacia de la inyección tardía (60% a los 12 meses) es consistente con lo que se observó en el grupo de MA (58% a los 12 meses), y las células congeladas parecen ser tan eficaces como las frescas.

La duración del beneficio clínico en los que respondieron a la inyección de MA sugiere la diferenciación in situ de los mioblastos en fibras musculares maduras. Esa diferenciación fue demostrada en el modelo animal preclínico de los autores, usando la inyección de mioblastos genéticamente marcados con proteína fluorescente verde en el esfínter lesionado de ratas [20].

Además, mientras muchos estudios sugieren que la inyección de MA lleva al injerto celular, queda por demostrar formalmente que las nuevas miofibras formadas establecen conexiones funcionales con los nervios, como se observó en el estudio con ratas. Los resultados alentadores de este ensayo clínico son compatibles con una posible terapia curativa a largo plazo para la IF. El seguimiento a largo plazo de estos pacientes será informativo.

En relación con la calidad de vida a los 12 meses después de la terapia, este tratamiento mejoró significativamente 2 de los 4 ítems del FIQL, esto es, estilo de vida, así como afrontamiento y comportamiento. Sin embargo, ese beneficio parece más pequeño en los puntajes FIQL que en los puntajes CCI.  Al respecto, es de señalar que 2 pacientes que respondieron positivamente al tratamiento rechazaron completar el cuestionario FIQL y someterse a investigación complementaria a los 12 meses.

Por lo tanto, es presumible que las variaciones en el FIQL y los datos paraclínicos, puedan estar aquí subestimados en cierto grado. Eso contrasta con 2 reportes alentadores previos [22,29], pero concuerda con los resultados a corto plazo del estudio publicado por Frudinger y col. [21]. Los pacientes en este estudio no fueron totalmente comparables en términos de edad y severidad de la incontinencia, con los pacientes de estudios previos que reportaron también un efecto positivo.

En esta cohorte de 12 pacientes que recibieron MA, 6 (50%) tenían insuficiencia del EAE asociada con disfunción neurológica, y 4 (33%) tenían una rotura asociada del esfínter interno. No se puede excluir que eso haya podido tener influencia en la tasa de respuesta.

Por otra parte, la heterogeneidad de la respuesta revelada por el estudio, genera la cuestión de los marcadores predictivos de respuesta y/o una definición más precisa de las indicaciones para la terapia celular en la IF. En el presente estudio, debido al tamaño limitado de la muestra, no se pudieron identificar esos marcadores predictivos.

En relación con la manometría anorrectal y la ultrasonografía, no se observó cambio después de 1 año de tratamiento, en concordancia con el estudio de Frudinger y col. [21]. Este estudio confirma que la inyección de MA es bien tolerada, segura, y que brinda beneficio clínico. Clínicamente, los únicos efectos adversos observados se relacionaron con la biopsia muscular, y fueron clasificados como no graves y rápidamente resueltos.

En paralelo con el monitoreo de los efectos adversos, los autores efectuaron un análisis extenso de los mioblastos para todos los pacientes. Como se esperaba por los resultados en células mesenquimáticas estromales humanas [32], o preparaciones de mioblastos [28], se evidenciaron algunas anomalías cariotípicas, ninguna de las cuales se asoció  con alguna ventaja en el crecimiento, dado que todas las preparaciones celulares finalmente entraron en senescencia replicativa.

Ninguno mostró potencial tumorogénico como lo demuestra la falta de crecimiento en cultivo de agar blando (un ensayo en el que sólo las células transformadas pueden proliferar), y la falta de anomalías moleculares en p53 individuales transcriptos. Es probable que esas anomalías genómicas erráticas sean originadas por el estrés celular causado por la manipulación in vitro y el cultivo.

La terapia celular puede ofrecer varios beneficios sobre la ENS. Puede ser atractiva para los pacientes que no desean someterse al implante de un dispositivo invasivo, o para aquellos con implantes de estimulador cardíaco o desfibrilador, expuestos a RMN, equipamiento ultrasónico o terapia radiante, o en el caso de fracaso del tratamiento con la ENS.

Sobre la base de los presentes hallazgos, estaría justificado efectuar un ensayo multicéntrico de fase 3, para comparar la terapia con MA con la ENS, con un objetivo final primario a 12 meses, y para determinar si la inyección de MA en el esfínter podría convertirse en el tratamiento estándar para la IF.

Los resultados de este ensayo de fase 2 indican que la inyección de mioblastos en el esfínter estriado de pacientes con IF brinda beneficio clínico a los 12 meses post tratamiento, con excelente tolerancia y seguridad. Esto abre perspectivas para la cura de la IF refractaria.

Comentario y resumen objetivo: Dr. Rodolfo D. Altrudi