Introducción

Los pacientes lesionados frecuentemente experimentan una pérdida de sangre suficiente como para necesitar una transfusión de sangre [1]. El objetivo de la transfusión de glóbulos rojos empacados líquidos (GREL) es restaurar la perfusión en los pacientes en shock, mediante la expansión del volumen intravascular y reemplazar la hemoglobina (Hb) transportadora de oxígeno. Aproximadamente 14 millones de unidades de sangre son transfundidas anualmente en los EEUU, haciendo de la transfusión de sangre una de las terapias más comúnmente realizadas en los pacientes de trauma [2,3].

Para muchos pacientes, la transfusión de GREL es una terapia salvadora de vida, con beneficios compensando los riesgos asociados. No obstante, varios estudios han mostrado que la transfusión de sangre está independientemente asociada con una mortalidad aumentada [4-8]. La razón para el aumento de la mortalidad es desconocida. Puede deberse, en parte, a la edad de la sangre.

La evidencia proveniente de estudios retrospectivos no randomizados sugiere que, tanto la transfusión de sangre como la edad de la sangre, están independientemente asociadas con una mortalidad y morbilidad aumentadas [9,10]. Las etiologías de los efectos negativos de la sangre vieja, que incluye tasas de infección aumentadas, aumento de falla orgánica y mayor mortalidad, no han sido delineadas, pero se considera que están relacionadas con algunos elementos de defecto del almacenamiento [8-10]. La sangre almacenada por hasta 42 días, sufre una “lesión por almacenamiento” con el paso del tiempo, que consiste en cambios tanto morfológicos como bioquímicos [11,12].

El progreso en el mantenimiento de la calidad y función de los GREL guardados ex vivo hipotérmicamente ha sido lento [13,14]. Las nuevas soluciones de almacenamiento no suprimen completamente los cambios metabólicos y físicos asociados con el envejecimiento de los glóbulos rojos [11,12]. Esa limitación podría ser superada con la criopreservación, que utiliza los efectos beneficiosos de las temperaturas ultrabajas, para suprimir la movilidad molecular y detener las reacciones metabólicas y bioquímicas [15,16].

En contraste con el almacenamiento hipotérmico, la fisiología de los glóbulos rojos, incluyendo la estructura de la Hb, membrana celular y energía celular, no es afectada por el almacenamiento de larga data en estado congelado [17-19].

El mantenimiento continuo de un adecuado flujo de sangre, continúa siendo un gran desafío. Existe disminución en la disponibilidad de la sangre por cuestiones estacionales o relacionadas con desastres, y es difícil mantener un suministro nacional constante de sangre, sin un derroche excesivo de ese precioso recurso.

Esas cuestiones son exacerbadas por la necesidad de tener disponibles los tipos menos comunes de sangre, y por la vida relativamente corta de los GREL. La disponibilidad de sangre, para los pacientes de trauma, está afectada profundamente por los escenarios con víctimas masivas, y por un número relativamente pequeño de pacientes que requieren transfusiones masivas.

También es altamente afectada por las regiones con mucha menos disponibilidad en las áreas rurales. Cada año, aproximadamente el 3% de la sangre donada expira antes de ser usada, resultando en un costo estimado de más de  $ 80 millones de dólares [20]. La posibilidad de almacenar glóbulos rojos por un período mucho más largo, podría aliviar significativamente la escasez impredecible asociada con un mayor uso y con el derroche de la sangre no usada.

Los glóbulos rojos empacados criopreservados (GREC) tienen el potencial para revolucionar la industria de los bancos de sangre, aumentando la vida útil de los glóbulos rojos desde 42 días hasta 10 años, sin una disminución de su eficacia durante el período de almacenamiento [21].

Los autores de este trabajo han demostrado previamente que la criopreservación y desglicerolización de los glóbulos rojos, resulta en una reducción de mediadores bioquímicos potencialmente peligrosos, y que la transfusión de GREC resulta en una mejor oxigenación tisular, comparada con los GREL [22,23]. El presente estudio fue efectuado para examinar la efectividad terapéutica y la seguridad de la transfusión de GREC en los pacientes de trauma. Los autores hipotetizaron que la transfusión de GREC es segura y efectiva en los pacientes de trauma y obtiene resultados clínicos equivalentes, comparada con los GREL.

Métodos

Se realizó un estudio prospectivo, randomizado, doble ciego en la Oregon Health & Science University (OHSU), el Houston/Memorial Hermann Hospital del University of Texas Health Science Center, el UT Southwestern/Parkland Memorial Hospital, el University of Texas Health Center en San Antonio, y el University of Cincinnati Medical Center. Este estudio fue aprobado por el Comité de Revisión Institucional de cada centro asistencial y registrado en ClinicalTrials.gov (NCT01038557), en donde puede obtenerse el protocolo completo. La OHSU sirvió como Centro Coordinador de Datos y laboratorio central para los ensayos específicos de investigación. Los pacientes de trauma hemodinámicamente normales, mayores de 15 años de edad, con un Injury Severity Score (ISS) mayor de 4 y anemia, fueron elegibles para este estudio.

Se obtuvo el consentimiento del paciente o de su representante legal. Una Hb menor de 7 mg/dL fue utilizada como umbral para la transfusión. Si la transfusión de sangre era ordenada por el equipo primario de los pacientes, se los enrolaba en el estudio y eran randomizados por el banco de sangre local, para recibir GREL jóvenes (≤ 14 días), GREL viejos (> 14 días) o GREC.

La randomización fue generada en la OHSU y determinada por un programa generador de números al azar, y la asignación de los pacientes fue determinada mediante el llenado de la línea siguiente de la lista. Las listas de randomización fueron estratificadas por sitio en un diseño de bloques permutados al azar. Una vez que el paciente era randomizado en un grupo de sangre, el banco de sangre de cada institución asignó a los pacientes, sobre la base del esquema de randomización.

Los pacientes recibieron sangre exclusivamente de ese grupo durante el resto de su hospitalización. Los criterios de exclusión incluyeron: imposibilidad de mantener la randomización de sangre a causa de limitaciones en el banco de sangre, necesidad de transfusión de emergencia, pacientes que tuvieron una transfusión masiva, lesiones bilaterales en las manos que impedían la medición espectroscópica del cercano infrarrojo, embarazo, estatus de prisionero y uso activo de medicamentos vasorreguladores.

Los GREC fueron provistos a cada centro asistencial por el Armed Services Blood Program, sin cargo, y almacenados en un frízer a -80ºC. Esos glóbulos rojos son congeladas en glicerol dentro de los 6 días de la donación, y almacenadas por hasta 10 años. Si el paciente era randomizado para recibir GREC, los glóbulos rojos eran descongelados y desglicerolizados utilizando ACP 215 (Haemonetics Corporation, Braintree, MA).

Esos glóbulos rojos estuvieron disponibles para la transfusión en aproximadamente 90 minutos. Los GREC descongelados fueron preparados para su uso potencial, en pacientes con consentimiento, con procedimientos quirúrgicos planificados y fueron transfundidos intraoperatoriamente o postoperatoriamente, según lo ordenado por el equipo primario. Los GREL fueron provistos por el banco de sangre de cada hospital. Todo el personal del banco de sangre fue entrenado en la preparación de los GREC antes del estudio. Los proveedores y los pacientes desconocían el tipo de transfusión realizada.
 

Ensayos de laboratorio

Las muestras de sangre fueron tomadas antes de la transfusión (línea de base), al final de la transfusión de cada unidad de sangre para las primeras 2 unidades, y 12 horas después de haberse completado la transfusión. Se tomaron también muestras de cada unidad de glóbulos rojos transfundida. Las muestras fueron recolectadas en tubos con citrato de sodio, centrifugadas inmediatamente, y el plasma o sobrenadante fue almacenado a -80º C hasta su análisis en la OHSU.

Los marcadores bioquímicos de función deteriorada de los glóbulos rojos, fueron investigados en las muestras de los pacientes y de las unidades. La Hb libre fue medida mediante ensayo por inmunoabsorción enzimática (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX). Empleando el Luminex Bio-Plex 200 (Luminex, Austin, TX), la haptoglobina, α2-macroglobulina, proteína C reactiva (PCR) y el amiloide sérico P, fueron analizados, utilizando el Bio-Plex Pro Human Acute Phase 4-Plex (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA); y las citoquinas inflamatorias (interleucina [IL]-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GMCSF), interferon- [ITF-], factor α de necrosis tumoral [FNT-α], fueron investigados usando el Bio-Plex Pro Human Cytokine 8-Plex Panel (Bio-Rad Laboratories, Inc).

El 2,3 difosfoglicerato (2,3 DFG) fue cuantificado en las muestras de los pacientes y de las unidades, como un marcador de la habilidad de la Hb transfundida para liberar O2 a los tejidos. La sangre entera de los pacientes fue recolectada en tubos heparinizados enfriados con hielo para su inmediata desproteinización. Las muestras fueron neutralizadas con una solución 3,5 M de carbonato potásico, y centrifugadas. El sobrenadante fue almacenado a -80º C y analizado con un kit disponible comercialmente (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania).

Los parámetros de coagulación sanguínea fueron investigados en las muestras de los pacientes. Los ensayos estándar de coagulación (tiempo de protrombina/índice internacional normalizado [TP/IIN], tiempo de tromboplastina parcial activada [TTPa], fibrinógeno, dímero-D y proteína C) fueron medidos usando un STA Compact Hemostasis System (Diagnostica Stago, Inc., Parsippany, NJ). Las muestras de sangre entera fueron analizadas por tromboelastografía (TEG 5000; Haemonetics Corporation), para evaluar el tiempo de formación del coágulo (tiempo r), la tasa de formación de coágulos (ángulo-α), el tiempo en minutos para alcanzar 20 mm de fortaleza del coágulo (tiempo k), máxima amplitud del trazado que representa la contribución plaquetaria, fortaleza absoluta del coágulo (valor G) y el grado de fibrinólisis (LY30).

Oxigenación tisular
Se colocó un sensor de espectroscopia cercana al infrarrojo en la eminencia tenar de una extremidad superior no lesionada, y se midió continuamente la oxigenación tisular (StO2; Hutchinson Technology, Inc, Hutchinson, MN), comenzando 1 hora antes de la primera transfusión de glóbulos rojos, hasta 12 horas después de haberse completado la segunda transfusión.

Parámetros clínicos
Los datos del estudio fueron recolectados y manejados utilizando las herramientas REDCap, de captura electrónica de datos disponibles en la OHSU. REDCap (Research Electronic Data Capture) es una aplicación segura, basada en internet, diseñada para apoyar la captura de datos para estudios de investigación, brindando: (1) una interface intuitiva para el ingreso de datos validados; (2) pistas de auditoría para el rastreo de la manipulación de datos y procedimientos de exportación; (3) instrumentos automatizados de exportación para la descarga transparente de datos en programas estadísticos comunes; y (4) procedimientos para importar datos de fuentes externas.

Análisis estadístico
Los autores basaron el poder estadístico del análisis en un estudio previo, que mostró que la transfusión de GREL viejos resulta en una reducción de la StO2 de aproximadamente un 5% [24]. Sobre la base de un poder estadístico del 80% y un α = 0,05, se estimó que se requeriría un total de 288 pacientes para completar el estudio. El estudio concluyó después de haberse enrolado a 254 pacientes, debido a la terminación del ciclo de financiación.

Los datos fueron analizados utilizando el programa SPSS, versión 22 (IBM Corp., Armonk, NY). Las estadísticas descriptivas fueron computadas para todas las variables del estudio, y la distribución estratificada de las parcelas fue examinada para verificar la normalidad de la distribución de las variables continuas. Las variables continuas normalmente distribuidas fueron comparadas con la prueba t o el análisis de la varianza (ANOVA), seguido por el análisis post hoc de Turkey, y reportadas como medias ± desvío estándar de la media. Los datos no paramétricos fueron comparados con la prueba U de Mann-Whitney, la de Kruskal-Wallis o la rank-sum de Wilcoxon, y reportadas como medianas (rango intercuartilar). Las variables dicotómicas fueron evaluadas con el análisis de 2. La significación fue fijada a P < 0,05 para todos los análisis.

Resultados
Doscientos cincuenta y seis pacientes fueron randomizados y recibieron sangre (84 GREL jóvenes, 86 GREL viejos y 86 GREC). El sexo, edad e ISS no difirieron entre los grupos. La población estuvo moderadamente lesionada, con un ISS medio de 19. No hubo diferencias en la duración de la estadía hospitalaria, de la estadía en la unidad de cuidados intensivos, de los días en respirador y de la mediana de la presión arterial sistólica, antes o después de la transfusión, entre los grupos.

La mediana del tiempo para los GREL fue de 32 días para el grupo viejo y de 7,5 días para el grupo joven. Los GREC fueron transfundidos a una mediana de 1 día después del descongelamiento y desglicerolización. Los pacientes en todos los grupos recibieron el mismo número de unidades de glóbulos rojos después de la randomización, y no hubo diferencias en la cantidad de pacientes que recibieron 1 unidad o hasta 5 unidades o más.

Tampoco hubo diferencias en el día, desde la admisión, cuando se dio la primera unidad randomizada. No hubo diferencias en los resultados clínicos adversos, incluyendo mortalidad, entre los grupos. Tampoco hubo diferencias en los resultados en el subgrupo de pacientes (dentro de cada grupo) que recibieron 5 o más unidades. No se reportaron reacciones por la transfusión en este estudio. No hubo diferencias en el cambio en la StO2, entre los grupos, desde la línea de base, en el curso de 3 horas.

Los marcadores bioquímicos e inflamatorios que influencian la función de los glóbulos rojos fueron medidos en las unidades de glóbulos rojos. De manera similar al estudio previo de los autores [22], los GREC contuvieron concentraciones más bajas de α-2 macroglobulina, haptoglobina, PCR y amiloide sérico P (P < 0,001 vs GREL viejos). Los GREC y los GREL jóvenes tuvieron además niveles más altos de 2,3-DFG (P < 0,01 vs GREL viejos), lo que facilitó la liberación de O2 desde los glóbulos rojos a los tejidos.

Los niveles de Hb libre fueron más bajos en el grupo de los GREL jóvenes y similares en los de GREC y GREL viejos. Las citoquinas anti-inflamatorias IL-4 e IL-10 estuvieron aumentadas el los GREC (P < 0,001 vs GREL nuevos y viejos). Los niveles de los marcadores inflamatorios GMCSF, ITF- e IL-6 estuvieron elevados en los GREC en comparación con los GREL viejos (P < 0,001); no obstante, IL-6 e ITF- eran apenas perceptibles en cualquiera de las muestras.

Los marcadores bioquímicos y los niveles de citoquinas fueron medidos también en las muestras de los pacientes. Los pacientes del grupo con GREC tuvieron niveles basales más bajos de PCR comparados con los del grupo de GREL viejos (P < 0,05). No hubo diferencias entre o dentro de los grupos en relación con la α-2 macroglobulina, haptoglobina o 2-3 DFG.

Los niveles de IL-2 estuvieron aumentados a las 12 horas en los pacientes que recibieron GREC (P < 0,05). Hubo aumentos significativos en la HB libre en el grupo de GREL viejos durante la transfusión, pero no en los otros grupos (P < 0,05 vs línea de base). Las pruebas estándar de coagulación (TP/IIN, TTPa, fibrinógeno y dímero-D) y los parámetros del tromboelastrograma (valor r, k, ángulo-α, amplitud máxima y LY30) no difirieron entre o dentro de los grupos, y las medianas de los valores estuvieron todas dentro de los límites normales.

Discusión
El presente estudio es el ensayo prospectivo randomizado, comparando los GREC con los GREL, más grande que se haya hecho hasta ahora. El mismo revela que la transfusión de GREC, GREL viejos y GREL jóvenes, tiene un efecto similar sobre los resultados clínicos en los pacientes de trauma. Esas transfusiones tienen también efectos similares sobre la oxigenación de los tejidos, mediadores bioquímicos, inflamación y parámetros de coagulación.

Los hallazgos de este ensayo son muy similares a los publicados recientemente de los ensayos ABLE (Age of Transfused Blood in Critical Ill Adults) y RECESS (Effects of Red Cell Storage Duration on Patients Undergoing Cardiac Surgery), que no revelaron diferencias en la mortalidad o resultados secundarios, en pacientes críticamente enfermos y pacientes de cirugía cardíaca, randomizados para recibir GREL viejos o GREL jóvenes [24,25]. Ninguno de esos ensayos se enfocó en los pacientes de trauma.

Los glóbulos rojos congelados con 40% (peso/volumen) de glicerol y almacenados a -80º C, son lavados después de descongelarlos para reducir el contenido de glicerol a menos del 1% [27-29]. Ese paso es beneficioso porque permite la remoción del glicerol, restos celulares, plaquetas, leucocitos, isoaglutininas anti-A y anti-B, el anticoagulante usado para la recolección y otras sustancias plasmáticas y no plasmáticas biológicamente activas, que puedan tener significación fisiológica por jugar un rol en la inflamación, disfunción vascular y reacciones a la transfusión [30-32]. Eso fue confirmado en este estudio por las cantidades marcadamente reducidas de α-2 macroglobulina, haptoglobina, PCR y amiloide sérico P, en los GREC.

Otros autores han mostrado que el lavado de los glóbulos rojos reduce las sustancias plasmáticas y no plasmáticas a menos del 5% de su valor original [33-35]. La exposición de los glóbulos rojos descongelados al lavado salino induce a un pequeño grado de hemólisis, pero puede ser una hemólisis selectiva de glóbulos rojos dañados o senescentes.

Rowe y col., demostraron que el daño “subhemolítico”, debido a la congelación, está relacionado in vivo con la edad del eritrocito, siendo los glóbulos rojos más viejos los más susceptibles [30]. Esos glóbulos rojos dañados probablemente no sobrevivirían si fueran transfundidos. La excelente sobrevida in vivo indica que las células más frágiles son removidas durante el proceso post descongelamiento. Eso podría explicar por qué los GREC fueron igualmente efectivos para elevar el hematocrito, a pesar de la remoción de los glóbulos rojos que ocurre con el paso de la desglicerolización [18,34,36].

Ha habido un uso extenso de los GREC en la práctica civil y militar, especialmente durante el período desde 1960 hasta 1980 [37-44]. El primer banco de glóbulos rojos criopreservados fue organizado en el Chelsea Naval Hospital, en Boston, MA, en 1956, y el primer estudio clínico investigando la seguridad y eficacia de la transfusión alogénica de GREC fue realizado en el US Naval Hospital, en Danang, Vietnam del Sur [40,45]. La sangre fue recolectada, procesada y criopreservada en hospitales navales en los Estados Unidos, y embarcada en contenedores de espuma de poliestireno, empaquetados con hielo seco.

Dentro de los 6 meses, 43 víctimas militares gravemente heridas que requirieron transfusión masiva, recibieron un total de 347 unidades de GREL y 307 unidades de GREC [40]. Los niveles post transfusión en plasma de Hb, bilirrubina, recuento de plaquetas, Hb urinaria y creatinina sérica, no fueron diferentes entre los pacientes transfundidos con GREC y GREL [40].

Se desarrolló un programa terapéutico de transfusión de componentes utilizando GREC en el Cook County Hospital en Chicago [46]. Los GREC han sido usados para hasta el 64% de las transfusiones, dependiendo de la disponibilidad de eritrocitos para congelado. La institución de GREC se asoció con una disminución en la incidencia de reacciones post transfusión, desde el 0,57% al 0,11% [46]. El New York Blood Center reportó una experiencia similar. Ese grupo instituyó el uso de los GREC en niños con talasemia en 1968, y demostró una disminución en la incidencia de reacciones febriles desde el 50% hasta el 1% [47]. Aún los GREL altamente lavados producen una tasa del 10% de reacciones febriles en esos pacientes [48].

El uso de GREC fue largamente abandonado a causa de preocupaciones médicas y logísticas. Los métodos previos de desglicerolización de los glóbulos rojos, comprendían técnicas abiertas no automatizadas, que introducían el potencial para la infección. El ACP 215 brinda un método cerrado, automatizado, para procesar los GREC descongelados, que acelera su disponibilidad.

Los GREC descongelados y desglicerolizados están aprobados por la Food and Drug Administration para su uso, hasta 14 días después de descongelados, brindando la posibilidad de iniciar la transfusión en ambientes de emergencia, de manera similar al plasma descongelado. Se eligieron 14 días, porque después de ese período el porcentaje de células viables cae por debajo de 80, comparado con la unidad donada original, y no por efectos peligrosos. Los GREC continúan siendo utilizados en los conflictos en Irak y Afganistán, y por los America´s Blood Centers, durante desastres, como un recurso limitado.

De acuerdo con el programa SPOTLIGHT del America´s Blood Center para el monitoreo de la disponibilidad de sangre, un promedio de aproximadamente el 30% de los sitios que reportan a nivel nacional, tienen disponible un suministro de sangre sólo para 2 días o menos [49]. La sangre recolectada después de desastres nacionales toma históricamente 2 días en llegar a los bancos de sangre, lo que representa demasiado tiempo de retraso para un uso inmediato en las víctimas.

Dentro del mes del 9/11, la Cruz Roja Americana recolectó 928.293 unidades de GREL, estimándose que 287.000 de ellas eran unidades extras de sangre. Finalmente, 49.860 de esas unidades fueron desperdiciadas, representando una tasa global de derroche del 5% y una tasa de desperdicio del 17% de las unidades extras recolectadas [50]. Es probable que el número total de unidades desperdiciadas sea mucho más grande, pero el número real no está disponible. Debido a la limitada disponibilidad del ACP 215, sólo 9.500 unidades de sangre tipo 0 fueron congeladas después del 9/11 [50]. Está claro que la tecnología actual para los bancos de sangre no está disponible para escenarios de desastres, y el uso de GREC  tiene un gran potencial para brindar una solución viable.

El costo estimado de 1 unidad de GREC es de $ 600 dólares, comparado con $ 200 dólares para una unidad de GREL. Debido al costo en aumento y a la complejidad logística asociados con los GREC, sería ideal mantener bancos de sangre congelada para suplementar a los bancos de sangre estándar con GREL, de manera de aumentar la flexibilidad necesaria para contar con glóbulos rojos durante los períodos de uso aumentado, escenarios de desastres, en áreas rurales con acceso limitado, y para los pacientes con tipos raros de sangre o desórdenes sanguíneos.

Limitaciones
Este estudio fue intencionalmente realizado en pacientes estables de trauma, después de la resucitación inicial, para enfocarse sobre los efectos de las transfusiones individuales de unidades. Los pacientes recibieron un número limitado de transfusiones, evitando un análisis de los efectos de las transfusiones de gran volumen sobre los resultados. Los hallazgos de este ensayo no pueden ser trasladados a escenarios de transfusiones masivas y los efectos de transfusiones de gran volumen de GREC siguen siendo desconocidos. Ese será el tema de estudios futuros.

El poder estadístico del análisis para este estudio se basó en una diferencia observada en la StO2 en un estudio previo, comparando la transfusión de GREL de menos de 21 días con GREL de 21 o más días. Este estudio no fue potenciado para equivalencia de los parámetros clínicos y, por lo tanto, debe ser considerado un ensayo piloto.

Conclusiones
Los autores han demostrado, en pacientes de trauma moderadamente lesionados, que la transfusión con GREC es igualmente efectiva y segura, comparada con la transfusión con GREL. Debido a la posibilidad de almacenar GREC por hasta 10 años y por hasta 14 días después de descongelarlos, la criopreservación representa una tecnología flexible, que tiene el potencial de cambiar sustancialmente el almacenamiento de sangre en diversos escenarios. Estudios futuros se enfocarán sobre las comparaciones entre transfusiones de GREL y GREC en ambientes de emergencia.

Comentario y resumen objetivo: Dr. Rodolfo D. Altrudi