La mayoría de todos los casos de asma se diagnostican temprano en la infancia,^1,2 sugiriendo que su origen es en la etapa fetal o muy temprano en la vida. Sibilancias recurrentes,^3,4 atopía,^5,6 e infecciones del tracto respiratorio inferior⁷ en la primera infancia se consideran factores de riesgo para enfermedades relacionadas con el asma.

La deficiencia materna de vitamina D durante el embarazo también se ha propuesto como un factor de riesgo para el desarrollo de asma en la infancia⁸; sin embargo, estudios observacionales que investigaron la relación entre el asma en niños y los niveles totales de 25-hidroxivitamina D (25-hidroxivitamina D₂ más 25-hidroxivitamina D₃; 25[OH]D) maternos o de sangre de cordón dejaron resultados inconsistentes.^9,10

Los parámetros inmunitarios presentes al nacer se han vinculado al desarrollo posterior de enfermedad atópica y asmática, lo que implica que los primeros cambios en el sistema inmune pueden preceder y apuntalar el desarrollo de la enfermedad.

El estado de la vitamina D durante el embarazo se ha relacionado con ciertos parámetros inmunes del neonato; por ejemplo, se demostró una correlación positiva entre los niveles de 25(OH)D de sangre del cordón y la liberación de IFN-γ por las células mononucleares de sangre de cordón (CMSCs) ante la estimulación por lipopolisacáridos (LPS)²⁴ y los niveles séricos de IL-10.²⁵

Sin embargo, los estudios que investigaron este vínculo han sido observacionales y no abordaron directamente si la vitamina D puede alterar activamente la respuesta del sistema inmune neonatal a un desafío innato o adaptativo.

En el presente estudio, el objetivo fue probar el efecto de la suplementación diaria con vitamina D₃ durante el embarazo en el sistema inmune del neonato usando muestras del Ensayo de Reducción de Asma Prenatal con Vitamina D (ERAPVD).^9,26

Se planteó la hipótesis de que la suplementación materna con altas dosis de vitamina D₃ promovería el sistema inmune innato del neonato, aumentando la capacidad de las CMSCs para responder a la unión del receptor tipo Toll (Toll-like receptor, TLR).

También se planteó un efecto más matizado de la suplementación materna con vitamina D₃ en las respuestas de linfocitos T neonatales, con supresión de la producción de IFN-? e IL-17A pero mejora en la de IL-10, además de una mayor producción de IL-10 inducida por dexametasona en neonatos de madres que reciben suplementos a altas dosis.

> Estudio auxiliar del ERAPVD

Se recogió sangre de cordón umbilical de 51 mujeres embarazadas reclutadas en el estudio ERAPVD. El tamaño de la muestra se basó en datos de estudios en adultos sobre síntesis de IL-10 inducida por 1,25 (OH)₂D₃ y fenotipado de células,^21,22 calculando que estudiar 48 sujetos produciría una potencia excelente (> 85%) para detectar diferencias entre los grupos de dosificación.

El objetivo fue reclutar 12 sujetos adicionales ante el riesgo de problemas técnicos con la investigación. Las participantes fueron asignadas al azar a las 10 a 18 semanas de embarazo a dosis altas o bajas de suplemento de vitamina D; 26 se suplementaron con 4400 UI/d de vitamina D₃, y 25 con 400 UI/d.

> Preparación y cultivo de CMSCs

Las CMSCs se aislaron por centrifugación en gradiente de densidad estándar, y se cultivaron a 2 x 10⁶ células/ml en medio RPMI solo o con la adición de LPS (de Escherichia coli 0111: B4m), PPG (peptidoglicano de S. aureus), CpG (oligonucleótido CpG tipo C ODN 2395), o PHA (lectina de Phaseolus vulgaris). Los sobrenadantes de cultivo se cosecharon a las 24 hs y se almacenaron sin agrupar a -80°C antes del análisis de citoquinas.

Las CMSCs se cultivaron a 1 x 10⁶/ml en medio RPMI en presencia de anti-CD3 unido a placa (1 mg/ml, OKT3) e IL-2 humana recombinante soluble (50 U/ml) para estudiar las respuestas adaptativas de células T. Los sobrenadantes se cosecharon después de 72 hs y se almacenaron a -80°C hasta el análisis. Todos los cultivos de CMSCs se realizaron por duplicado, y se midieron los niveles de citoquinas de cada pocillo independientemente.

> Citometría de flujo

Para la fenotipificación de las principales poblaciones de células inmunes en sangre de cordón, las muestras se tiñeron con anticuerpos apropiados y se obtuvieron sus datos con un citómetro de flujo BD LSR II.

> Mediciones de citoquinas

Se determinaron las concentraciones de citoquinas en los sobrenadantes de cultivos individuales utilizando un ensayo de matriz de cuentas citométricas.

> Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) cuantitativa

Las CMSCs (2x10⁶) se lisaron en 750 ml de reactivo Trizol y se almacenaron a -80°C hasta la extracción y análisis de ARN. El ARN se aisló y se purificó usando una Mini columna RNAeasy, con tratamiento adicional con DNasa. La cantidad de ARN se determinó usando el kit Agilent RNA 6000 Pico. Cien nanogramos de ARN fueron transcriptos inversamente en ADNc, y la PCR-TR cuantitativa se realizó por triplicado.

Todos los ensayos inmunes se realizaron de manera ciega, y los datos fueron analizados independientemente. Para el análisis del efecto de la suplementación con vitamina D en la producción de citocinas por las CMSCs en respuesta a la estimulación innata, se probó una hipótesis nula global de ningún efecto de la suplementación en la producción media de citoquinas utilizando modelos ANOVA de efectos fijos multivariados.

Se usaron modelos ANOVA de efectos aleatorios para probar los efectos de la vitamina D en la expresión del TLR en CMSCs y la producción de citocinas por células T después de la estimulación inmune adaptativa. Se realizaron dos cultivos de CMSCs replicados separados para cada condición de cultivo para cada donante.

Las réplicas biológicas resultantes se analizaron como medidas repetidas para capturar los efectos de la variación biológica en el análisis. Otras réplicas técnicas en los análisis de PCR fueron estudiadas utilizando el promedio medio de los valores replicados por práctica estándar.

Características de la población de estudio

Se usaron muestras de sangre de cordón de 51 participantes del ERAPVD para análisis inmunológico: 26 del brazo suplementado con 4400 UI/d de vitamina D₃ y 25 del brazo con 400 UI/d. No hubo diferencias maternas significativas en la raza, edad, índice de masa corporal antes del embarazo, o antecedentes de eccema, dermatitis atópica, asma, fiebre del heno, y rinitis alérgica entre los 2 brazos de estudio.

La proporción de partos por cesárea, el sexo de los recién nacidos y la edad gestacional tampoco fueron significativamente diferentes entre los 2 brazos. Al enrolamiento (10-18 semanas de gestación), los niveles medios de 25(OH)D circulantes en las madres de ambos brazos estaban en un rango deficiente-insuficiente (<30 ng/ml), aunque los niveles medios fueron más bajos (P = 0,05) en el grupo posteriormente suplementado con 4400 UI/d de vitamina D₃.

Después de 22 a 30 semanas de suplementación (es decir, en el tercer trimestre del embarazo), las mujeres que recibían 400 UI/d permanecieron en rango insuficiente (<30 ng/ml), con solo 6 de 23 pacientes con un nivel suficiente de vitamina D.

La concentración media en mujeres recibiendo 4400 UI/d se movió al rango suficiente (> 30 ng/ml), logrando una concentración media de 25(OH)D de 35 ng/ml, con 17 de 25 participantes demostrando suficiencia de vitamina D.

Faltaron datos para 3 mujeres en el brazo de 400 UI y para 1 mujer en el de 4400 UI. Por lo tanto, la dosis de 4400 UI/d fue efectiva en aumentar los niveles de 25(OH)D a la suficiencia dentro de este subconjunto de pacientes, y resultó en una diferencia significativa (P = 0,002) en los niveles maternos de 25(OH)D₃ en comparación con el grupo de 400 UI/d para el tercer trimestre del embarazo.

El efecto de la suplementación materna también se reflejó en los niveles de 25(OH)D de sangre de cordón, que fueron significativamente (P = 0,01) más altos en el grupo que recibió 4400 UI/d. Los bebés nacidos en el grupo de 4400 UI/d fueron significativamente más largos (P = 0,03) y más pesados (P = 0,03) que en el grupo de 400 UI/d.

La suplementación con 4400 UI/d de vitamina D₃ durante el embarazo vs. 400 UI/d no tuvo un efecto significativo en las proporciones relativas de los principales tipos de células inmunes en sangre de cordón. Las células dendríticas mieloides, pero no las plasmacitoides, mostraron una tendencia (P = 0,051) hacia una frecuencia mejorada en las CMSCs de bebés dentro del grupo de 4400 UI/d en comparación con el grupo de 400 UI/d.

Para abordar la hipótesis de que la suplementación con vitamina D₃ en el embarazo promovería el sistema inmune innato del neonato, se cultivaron CMSCs de los 2 brazos de estudio durante 24 horas con LPS (específico del TLR4), peptidoglicano (específico del TLR2), oligonucleótido CpG tipo C (CpG, específico del TLR9), PHA (mitogénico) o medio solo. Cada muestra se cultivó en 2 pocillos separados, y los sobrenadantes de cultivo fueron  analizados independientemente para concentraciones de 7 citoquinas innatas.

Las CMSCs cultivadas en medio solo liberaron una cantidad mínima o indetectable de citoquina en 24 horas, salvo IL-8, cuyos niveles oscilaron entre 125 a 280,000 pg/ml. Las concentraciones medias geométricas de citoquinas fueron mayores en el brazo de suplementación con 4400 UI/d que en el brazo de suplementación con 400 UI/d en 27 de las 28 combinaciones de estimulación de citoquinas (P = 0,0009).

En otros análisis se examinó el efecto de la vitamina D₃ en la producción de citocinas innatas individuales. Para cada citoquina medida, la estimulación de las CMSCs con cada uno de los 3 ligandos TLR y PHA indujo un rango significativo de concentraciones de citoquinas en sobrenadantes de cultivo, y la suplementación materna con vitamina D₃ exhibió efectos significativos o limítrofes en los niveles medios geométricos de citoquinas de GM-CSF (P = 0,010), TNF-α (P = 0,131), IL-1b (P = 0,094) e IFN-? (P = 0,077).

Las CMSCs de neonatos de madres suplementadas con 4400 UI/d de vitamina D₃ tuvieron niveles de expresión génica más altos de TLR2 (P = 0,02) y de TLR9 (P 5= 0,02) que las de 400 UI/d, lo que podría explicar en parte el aumento de las sensibilidades a peptidoglicano y CpG en este grupo. La expresión de TLR4 no fue significativamente mayor en el grupo de 4400 UI/d.

Las CMSCs de los 2 brazos del estudio se cultivaron con anti-CD3 e IL-2 para establecer el efecto de la suplementación con vitamina D₃ durante el embarazo en las respuestas adaptativas de linfocitos T neonatales. El cultivo de CMSCs con este estímulo policlonal de células T resultó en la producción detectable de una gama de citocinas de células T (IFN-, IL-5, IL-10, IL-13 e IL-17A) después de 72 horas. Las CMSCs del grupo con 4400 UI/d de vitamina D₃ secretaron mayores niveles medios geométricos de IL-17A, efecto contrario al planteado. No hubo diferencias significativas en los niveles de otras citoquinas medidas entre los 2 brazos; sin embargo, hubo una tendencia a niveles más bajos de IL-10 y más altos de IL-13 en el grupo de 4400 UI/d.

Se evaluó si la suplementación con dosis más altas de vitamina D₃ mejoraría la producción de IL-10 inducida por dexametasona a partir de cultivos de CMSCs estimulados con anti-CD3 y IL-2. El cambio en la producción de IL-10 en respuesta al tratamiento con dexametasona mejoró en los cultivos de CMSCs del brazo suplementado con 4400 UI/d en comparación con el de 400 UI/d y fue estadísticamente significativo entre los 2 brazos de estudio (P = 0,018).

Sin embargo, no se observó un efecto de la suplementación con vitamina D₃ en el nivel de expresión del receptor de glucocorticoides en las CMSCs que pudiera explicar este hallazgo. La producción de IFN-?, IL-13, IL-5 e IL-17A en ambos brazos se redujo por la adición de dexametasona; no hubo un efecto significativo de la suplementación con vitamina D₃ en esta respuesta.

Este estudio investigó el efecto de la suplementación con 4400 UI/d de vitamina D₃ durante el segundo y tercer trimestre del embarazo sobre la respuesta inmune del neonato utilizando muestras de sangre de cordón umbilical de bebés nacidos dentro del ERAPVD.^9,26

Este régimen condujo a un aumento de los niveles medios maternos circulantes de 25(OH)D en el rango de suficiencia (> 30 ng/ml). En contraste, la suplementación con la dosis actual recomendada de 400 UI/d no mejoró los niveles maternos de 25(OH)D.

El primer hallazgo importante fue la mejora significativa de la producción de citoquinas proinflamatorias en respuesta a estímulos innatos y mitogénicos en cultivos de CMSCs de bebés nacidos dentro del brazo de 4400 UI/d de vitamina D₃.

Este efecto no fue específico de ninguna citoquina o estimulación particular dado que todas las combinaciones fueron en promedio más altas en el grupo con 4400 UI/d dando lugar a aumentos de GM-CSF, IFN-?, IL-1b, IL-6 e IL-8. Tal efecto no se observó con la IL-10.

La capacidad de la vitamina D₃ durante el embarazo de mejorar las respuestas innatas en el período neonatal son respaldadas por estudios observacionales en la vida temprana, que muestran una relación positiva entre las respuestas de citoquinas y los niveles de 25(OH)D en sangre de cordón.^24,29

Además, se observaron niveles más altos de expresión para TLR2 y TLR9 en CMSCs del grupo con 4400 UI/d. Dado que el efecto más fuerte de la suplementación con D₃ se observó después de la estimulación con PHA, la diferencia en la expresión de estos receptores podría no explicar completamente la diferencia en la capacidad de respuesta entre ambos brazos de estudio.

Sin embargo, la PHA activa linfocitos innatos, como las células natural killers, y también actuaría como un agonista de TLR.³⁰ El análisis celular insinuó una mayor frecuencia de células dendríticas mieloides, pero no plasmacitoides, en el grupo con 4400 UI/d.

Es posible que las células dendríticas puedan contribuir directamente a la mejora de los niveles de citoquinas proinflamatorias y/o indirectamente al mejorar la activación de células T en estos cultivos a corto plazo. Sin embargo, el mecanismo por el cual las altas dosis de vitamina D3 materna mejoran la aptitud de las células inmunes innatas para responder a la estimulación sigue siendo incierto.

La capacidad de respuesta de las células inmunes a los estímulos infecciosos al nacer es muy variable.³¹ Las respuestas más fuertes de citocinas neonatales, en particular para IFN-, se han asociado con reducción de la enfermedad respiratoria,^32-34, así como con una incidencia tardía de sibilancias, alergia y asma^11-13,35,36 en la niñez. Además, niveles de expresión más bajos de TLR en

células inmunes de sangre de cordón umbilical se han relacionado con la alergia materna.^37,38 Por lo tanto, la suplementación con altas dosis de vitamina D₃ durante el embarazo para mejorar la aptitud inmune innata en el neonato podría limitar las perturbaciones inmunes en la vida temprana vinculadas al desarrollo del asma.

El segundo hallazgo importante fue que la suplementación con vitamina D₃ a 4400 UI/d condujo a una mejor producción de IL-17A en cultivos de CMSCs en respuesta a la estimulación policlonal de células T. IL-17A y las citoquinas asociadas a T_H17 juegan un papel crucial en la defensa inmune pulmonar³⁹ y en la inmunidad neonatal⁴⁰ pero en exceso también pueden tener efectos patológicos.

La regulación positiva en este estudio respaldaría la capacidad de la vitamina D para promover las acciones antimicrobianas protectoras de IL-17A en el neonato. Estos datos fueron inesperados dados los informes previos que demuestran que la 1,25(OH)₂D₃ inhibe la síntesis de IL-17A y T_H17^19,20,42 además de los propios datos que muestran que la IL-17A es fuertemente inhibida en cultivos de CMSCs estimulados por células T policlonales en presencia 1,25(OH)₂D₃. Estos resultados contradictorios resaltan la importancia del contexto y del momento en las acciones de la vitamina D sobre el sistema inmune.

Aunque no hubo efecto de la suplementación en los niveles de IL-10, se observó una mejor respuesta de las CMSCs del grupo con 4400 UI/d de vitamina D₃ al tratamiento in vitro con dexametasona para la producción de IL-10. Este fenómeno de la vitamina D se ha observado en adultos con asma resistente a los esteroides^23,43 y podría ser relevante en el contexto de la vida temprana, cuando los glucocorticoides y la vitamina D influirían en el desarrollo pulmonar,⁴⁴ aunque este efecto clínico es un área para más investigación.

Este estudio tuvo poco poder para investigar los vínculos entre los parámetros inmunes al nacer y los resultados clínicos en niños; sin embargo, el ERAPVD principal reportó una tendencia para una menor incidencia de asma/sibilancias recurrentes, de infecciones respiratorias bajas y de sensibilización a alérgenos a los 3 años de edad en el grupo cuyas madres recibieron 4400 UI/d de Vitamina D₃ en comparación con 400 UI/d,.

Los puntos fuertes de este estudio fueron que los participantes provenían de un ensayo controlado aleatorio y que se realizó un conjunto integral de ensayos inmunológicos para evaluar tanto las respuestas inmunes innatas como adaptativas. La principal limitación de este estudio fue tener poco poder para analizar las asociaciones entre los parámetros inmunes y los resultados clínicos posteriores.

En resumen, este es el primer estudio que reportó los efectos de la suplementación en el embarazo con vitamina D a niveles de suficiencia sobre la capacidad de respuesta del sistema inmune en la vida temprana. Se observó que los neonatos de madres suplementadas con 4400 UI/d de vitamina D₃ tuvieron mayores respuestas de citoquinas innatas, mayor producción de IL-17A en respuesta a la estimulación de células T, y mayor producción de IL-10 inducida por dexametasona.

Dada la evidencia de la asociación entre las respuestas inmunes neonatales intensas en la vida temprana con la disminución del desarrollo del asma, este efecto probablemente conducirá a una mejor salud respiratoria en la vida temprana. Futuros estudios deberán abordar el efecto longitudinal de la suplementación con vitamina D₃ en el embarazo sobre los resultados clínicos e inmunes en el lactante.