Introducción
Las adherencias postoperatorias representan una triple carga, con pacientes afectados por una significativa morbilidad [1], cirujanos afectados por la carga de trabajo aumentada debida a la adhesiolisis [2] y el sistema de salud afectado por costos considerables [3].
Las adherencias resultan de una cascada de eventos que se inicia con el trauma quirúrgico. Cada peldaño en esta cascada es un objetivo potencial para la prevención de las adherencias [3]. No obstante, las barreras físicas siguen siendo el único elemento autorizado para la reducción de las adherencias en los Estados Unidos y Europa. Estos agentes previenen la formación de los puentes de fibrina, que constituye una etapa temprana en la adhesiogénesis, mediante la separación física de las áreas traumatizadas de los tejidos vecinos. El Seprafilm (Genzyme Corporation, Cambridge, Mass) (ácido hialurónico / carboximetilcelulosa) es una de las barreras más comúnmente utilizadas [4,5] y el único agente que demostró reducir la obstrucción del intestino delgado [6]. Sin embargo, la aplicación laparoscópica de rutina de este agente es irreal debido a sus propiedades materiales.
El D,L-polilactido-ε-caprolactonatrimetilenocarbonato (copolímero PCT) es un biomaterial recientemente desarrollado, que es usado como un sustituto de la piel para las víctimas de quemaduras [7,8] y para los sitios donantes de injertos de piel [9]. Sus propiedades racionalmente diseñadas hacen del copolímero PCT un candidato como barrera anti adherencia. En particular, el material tiene propiedades que son ventajosas para su aplicación laparoscópica. A la luz de la complejidad y alcance cada vez mayores de la cirugía mínimamente invasiva [10], este biomaterial podría representar un importante avance. Por lo tanto, el presente estudio apunta a evaluar el copolímero PCT como una barrera para las adherencias.
Material y métodos
El copolímero PCT fue producido mediante un proceso patentado (U.S. 670658) que involucra la polimerización de los monómeros, disolución en solventes orgánicos y subsiguiente procesamiento mediante una fase de inversión modificada y deshidratación por congelación. El producto final fue una membrana porosa con 80 mL m-2 h-1 de permeabilidad al agua y temperatura de transición vítrea de alrededor de 32º C.
Microscopía electrónica
Muestras del copolímero PCT fueron recortadas, lavadas y fijadas en glutaldehído. Las muestras fueron luego lavadas de nuevo, congeladas instantáneamente en nitrógeno líquido y secadas al vacío en un liofilizador por 12 días. Finalmente, las muestras fueron depositadas mediante atomización y examinadas usando un microscopio electrónico (DSM962, Carl Zeiss Inc., Oberkochen, Gemany).
Ensayo de citotoxicidad in vitro
Los fibroblastos (L-929) fueron sembrados a una densidad de 50.000 células en 1 mL de medio de cultivo estándar (Dulbecco’s modified eagle’s medium [DMEM] + 10% de suero bovino fetal) e incubados en presencia o ausencia de la membrana de copolímero PCT irradiada con rayos gamma (25 kGy). La viabilidad celular fue evaluada después de 48 horas mediante la medición de la reducción del 5-(3-carboximetoxyfenil)-2-(4,5-dimetiltiazolil)-3-(4-sulfofenil) tetrazolium (MTS) al correspondiente producto formazan, que es directamente proporcional al número de células vivas en el cultivo.
Profilaxis de adherencias in vivo
El protocolo para el estudio animal fue aprobado por el Ethics Committee of the University of Tübingen. Ratas Wistar (Charles River Laboratories, Germany) con un rango de peso de 230-270 gr, fueron alojadas bajo condiciones estandarizadas de laboratorio (21º C en un ciclo de luz-oscuridad de 12:12 hs). El alimento y el agua estuvieron disponibles sin restricciones. Todas las operaciones fueron realizadas por el mismo cirujano usando guantes libres de talco. Los animales fueron anestesiados con ketamina (100 mg/kg) y xilacina (5 mg/kg) de acuerdo con protocolos estándar. Después de una incisión ventral de unos 5 cm de longitud, el peritoneo parietal fue traumatizado a cada lado en un área de 20 x 5 mm utilizando el electrocauterio (generador bipolar Vio 300D ajustado a 40W; ERBE Elektromedizin, Tübingen, Germany). Adicionalmente, 5 suturas interrumpidas (3-0 Vicryl; Ethicon, Somerville, NJ) fueron colocadas equidistantes, sobre el área traumatizada (Fig. 1). Subsecuentemente, los animales fueron tratados como por randomización con el grupo experimental revelado al cirujano después de la traumatización del animal respectivo. En el grupo de tratamiento, cada área traumatizada (n = 30) fue cubierta con un parche de 4 x 3 cm de copolímero PCT (Fig. 2)
• FIGURA 1: Lesión experimental no tratada antes de la colocación de la última sutura.
• FIGURA 2: Aplicación del copolímero PCT. La membrana fue aplicada directamente sobre las lesiones experimentadles sin la necesidad de sutura (A). Para el momento en que la pared abdominal estaba lista para el cierre, el copolímero OCT había cambiado a un estado rojizo y se había adherido cómodamente al peritoneo (B).
En el grupo de control no se aplicó nada sobre las áreas traumatizadas (n = 30). La incisión en la línea media fue cerrada en 2 planos. Postoperatoriamente, los animales recibieron analgesia con buprenorfina (0,05 mg/kg) y fueron observados diariamente para las indicaciones clínicas de los efectos colaterales (pérdida de peso, apatía o mala apariencia). El día 14º postoperatorio, la cantidad de adherencias fue evaluada utilizando un puntaje completamente cuantitativo calculado como la sumatoria del ancho de las adherencias individuales dividido por el ancho del área traumatizada. La calidad de la adherencia fue considerada “firme” si la escala de una regla era visible a través del tejido; de otra manera, fue considerada “densa”. Una autopsia completa de cada animal fue realizada para identificar cualquier indicación de efectos colaterales.
Histología
Todas las áreas traumatizadas (n = 60) fueron resecadas en bloque junto con cualquier tejido adhesivo y fijadas en una solución de formalina al 4% tamponada con fosfato (PBS). Después del procesamiento de rutina del tejido, se cortaron secciones de 4-5 µm y se tiñeron con hematoxilina y eosina de acuerdo con protocolos estándar.
Análisis estadístico
Los resultados se expresan con la desviación estándar (DE) para los datos normalmente distribuidos o, de otra manera, como medianas con el rango. La significación estadística fue determinada utilizando la prueba U de Mann-Whitney con un nivel de significación de P < 0,05. Se tomaron en cuenta las correcciones de Bonferroni para determinar la significación para las 3 comparaciones de la cantidad de adherencias.
Adaptación para la aplicación laparoscópica
El protocolo del estudio humano fue aprobado por el mismo comité. Se obtuvo un consentimiento informado de una paciente admitida para una miomectomía laparoscópica de rutina. Después del procedimiento, que involucró el uso de electrocauterio (generador bipolar Vio 300D; ERBE Elektromedizin) y suturas (Vicryl 0; Ethicon), la membrana de copolímero PCT fue enrollada e insertada a través de un puerto laparoscópico. Fue desenrollada en la cavidad peritoneal y posicionada sobre el sitio en donde había sido removido el mioma. Subsecuentemente, los puertos laparoscópicos fueron removidos y las heridas fueron cerradas de la manera usual.
Resultados
Microscopía electrónica
La microscopía electrónica de la membrana de copolímero PCT demostró una estructura bien organizada con el tamaño de los poros variando entre 2 y 10 µm (Fig. 3)
• FIGURA 3: Ultraestructura de la membrana de copolímero PCT. La microscopía electrónica demostró una estructura porosa organizada.
Ensayo de citotoxicidad in Vitro
La medición colorimétrica del producto formazan del ensayo MTS no reveló diferencia significativa en la viabilidad celular entre el copolímero PCT (media, 0,267; DE, ±0,012) y el control (media, 0,282; DE, ±0,016).
Profilaxis de adherencia in vivo
En el grupo control, las adherencias cubrieron un 78% (rango, 35-100%) de las áreas traumatizadas. El tratamiento con el copolímero PCT disminuyó el área cubierta al 32% (rango, 0-100%) (P < 0,01) (Fig. 4A). Las adherencias fueron subclasificadas de acuerdo con su calidad en “densas” y “firmes”. La cantidad media de adherencias densas fue del 25% (rango, 0-90%) en el grupo control. Esta cantidad observada disminuyó al 0% (rango, 0-100%) en los animales tratados con el copolímero PCT (P < 0,01) (Fig. 4B). La cantidad media de adherencias firmes fue del 35% (rango, 0-90%) en el grupo control y disminuyó al 13% (rango, 0-75%) en el grupo con copolímero PCT (P < 0.01) (Fig. 4C).
• FIGURA 4: Profilaxis in vivo de las adherencias. Porcentaje de cobertura de las áreas traumatizadas con adherencias de cualquier calidad (A), con adherencias densas (B) y con adherencias firmes (C). Las medianas (barras horizontales), medias (diamantes), rangos de intercuartilos (cuadrados) y 10º-90º rango de percentilos (barras de error) están indicados.
La observación clínica diaria de los animales no mostró indicaciones de ningún efecto colateral.
Histología
En el grupo control, el examen de las áreas relevantes demostró una serosa con tejido fibroso revestido por células planas mesoteliales (Fig. 5A). En los animales tratados con copolímero PCT el biomaterial fue separado de las secciones histológicas por los procedimientos de inclusión. La histología mostró algunos materiales residuales pero indicó principalmente cavidades vacías en lugar del biomaterial. Esas cavidades estaban cubiertas por una monocapa de células planas mesoteliales (Fig. 5B y C). No se observó evidencia de una reacción inflamatoria aumentada en el grupo de tratamiento. En los sitios de las suturas se halló la reacción esperada por cuerpo extraño con células gigantes multinucleadas en ambos grupos. Las autopsias no demostraron indicación de efectos adversos.
• FIGURA 5: Tinción con hematoxilina y eosina
Adaptación para la aplicación laparoscópica
La aplicación laparoscópica humana fue exitosa (Fig. 6). Una consulta de seguimiento a los 3 meses reveló la ausencia de síntomas o signos de complicaciones. La paciente específicamente negó dolor, distensión abdominal, constipación, náuseas, vómitos o dispareunia.
• FIGURA 6: Aplicación laparoscópica de una membrana de copolímero PCT después de una miomectomía.
Discusión
El copolímero PCT disminuyó significativamente la formación de adherencias en un modelo animal que involucró electrocoagulación y suturas (Fig. 4). Además, los autores no observaron indicación de ningún efecto adverso en los animales después de la evaluación clínica, autopsia y examen histopatológico de los sitios de implante (Fig. 5). La aplicación laparoscópica humana fue exitosa (Fig. 6).
Las propiedades racionalmente diseñadas del copolímero PCT resultaron en varias características ventajosas. Primero, la membrana de copolímero PCT fue diseñada con una temperatura de transición vítrea de alrededor de 32º, que es más baja que la temperatura corporal pero más alta que la temperatura ambiente. El punto de transición vítrea define la temperatura por arriba de la cual los sólidos amorfos, tal como los polímeros, cambian de un estado vítreo rígido a un estado blando, flexible y gomoso. A la temperatura ambiente, la membrana de copolímero PTC existe en su estado vítreo (Fig. 2A) y puede ser convenientemente preparada para su aplicación mediante corte con la forma deseada. Al introducirla dentro de la cavidad abdominal, cuya temperatura está por encima del punto de transición vítrea, la membrana de copolímero PCT cambia a un estado gomoso y se adapta óptimamente a la anatomía seleccionada (Fig. 2B). Los ajustes de la temperatura de transición vítrea son posibles dentro de un rango de 25º a 40º C mediante el cambio de la proporción relativa de monómeros. Por lo tanto, el marco de tiempo intraabdominal durante el que el material existe en su estado vítreo puede ser fácilmente alargado para permitir un tiempo extra para aplicar el material antes de que adopte el estado gomoso. El estado vítreo es fácil de manejar, aún con instrumentos laparoscópicos. A diferencia del copolímero PTC, el Seprafilm (Genzyme Corporation) es quebradizo y no puede ser movido fácilmente después de entrar en contacto con el tejido húmedo. Su transparencia también lleva a una visibilidad subóptima. Por esas razones, el uso del Seprafilm en la cirugía laparoscópica de rutina no es práctico. Este resultado contrasta con la membrana de copolímero PCT, que fue exitosamente aplicada laparoscópicamente (Fig. 6).
Segundo, la membrana de copolímero PCT tiene una estructura porosa altamente organizada (Fig. 3) que forma la base de su adherencia al peritoneo húmero. El sistema de poros interconectados conduce a la acción capilar sobre el fluido peritoneal. Esta acción resulta en fuerzas adhesivas intermoleculares entre la membrana y el fluido, que exceden por lejos a la fuerza gravitacional sobre la membrana.
Tercero, el copolímero PCT es totalmente degradable por hidrólisis en su monómeros. La experiencia con el uso humano como un sustituto artificial de la piel [7-9] muestra que este proceso toma 4-6 semanas. Es importante que durante la degradación no se concentran o forman productos peligrosos. Por lo tanto, los monómeros en el copolímero fueron seleccionados para evitar las reacciones tóxicas. Cada componente de la membrana de copolímero, llamados lactido, caprolactona y trimetileno carbonato, están siendo ya usados en la sala de operaciones como componentes en otros copolímeros absorbibles. Ejemplos de materiales de sutura degradables usados rutinariamente basados en esos componentes incluyen Vicryl (Ethicon Endosurgery, Inc., Cincinnati, Ohio) (lactido-glicolido copolímero), Monocryl (Ethicon Endosurgery Inc.) (glicolido-caprolactona copolímero) y Maxon (American Cyanamid Company, Wayne, NJ) (glicolido-trimetileno-carbonato copolímero).
Finalmente, la permeabilidad acuosa de las membranas de copolímero PCT es aproximadamente 80 mL m-2 h-1, lo que debería disminuir la acumulación de colecciones líquidas en los lugares operatorios cubiertos y, por lo tanto, apoyar la cicatrización.
Futuras mejoras en el copolímero podrían incluir el añadido de sustancias farmacológicamente activas para la liberación local de la droga. De esta manera, múltiples peldaños en la cascada de la adhesiogénesis [3] podrían ser atacados simultáneamente para obtener efectos aditivos.
La presente investigación evalúa la eficacia de las membranas de copolímero PCT como barreras para las adherencias en un modelo animal que involucra uso de electrobisturí y suturas. Este modelo imita estrechamente a las circunstancias clínicas. Las adherencias resultantes fueron punteadas 14 días postoperatoriamente, lo que es posterior a la fase crítica de 3-5 días durante la cual las adherencias pueden formarse [12]. El modelo también permite la medición de las adherencias resultantes sobre un escala totalmente cuantitativa [13]. Los métodos de evaluación de los autores pueden ser fácilmente y objetivamente replicados en otros laboratorios y son preferibles a otras mediciones que descansan sobre escalas de intervalo o escalas ordinarias de variables.
Los autores concluyen en que las membranas de copolímero PCT son candidatas para una evaluación clínica adicional. Los estudios futuros deberían examinar la cinética exacta de la degradación intraperitoneal del copolímero PCT. También necesitan ser estudiados parámetros de seguridad más elaborados, que podrían incluir un ensayo clínico formal de fase I con pacientes seguidos durante un largo período de tiempo para identificar cualquier efecto adverso a largo plazo. Finalmente, la eficacia de la reducción de adherencias en pacientes humanos tendrá que ser probada mediante una segunda laparoscopía (second look).
♦ Comentario y resumen objetivo: Dr. Rodolfo D. Altrudi
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