Introducción

En la enfermedad de Alzheimer (EA), la quinasa GSK-3beta (glycogen synthase kinase-3beta) es la principal responsable de la hiperfosforilación de la proteína tau, debido a la inhibición de las moléculas PI3K/Akt, que controlan la actividad de la enzima, lo que se traduce en un aumento de esta.

Este mecanismo subyacente a la EA determina que tau, proteína que interacciona con los microtúbulos y los estabiliza para permitir su ensamblaje en el citoesqueleto, en el estado hiperfosforilado, forme ovillos neurofibrilares, proceso celular que comprende una serie de eventos conducentes a la neurodegeneración y muerte neuronal.

Entre ellos, se destaca la disminución del transporte axonal y la alteración de la plasticidad sináptica en neuronas del hipocampo, lo que concuerda con la aparición de demencia en personas de edad avanzada con EA y el deterioro cognitivo observado en modelos con animales. En consecuencia, evitar la alteración en la fosforilación de tau parece ser fundamental para controlar el avance de la EA.

En este sentido, se ha determinado que la hiperfosforilación de la isoforma de mayor extensión de tau (tau 441), expresada de manera estable en células embrionarias renales humanas HEK293 (human embryonic kidney cells) por efecto de forskolina, es disminuida por escitalopram, un inhibidor selectivo de la recaptación de serotonina (ISRS). Si bien, se desconocen en este modelo las vías moleculares implicadas, se ha comprobado que el deterioro cognitivo en la EA se encuentra asociado con el déficit de serotonina (5-HT) y su receptor (5-HT1AR), localizados en el hipocampo.

De importancia significativa, es la capacidad de los ISRS, en particular, la fluoxetina, de modular la cascada de señalización PI3K/Akt/GSK-3beta, mediante la activación de PI3K/Akt (impide su bloqueo provocado por estrés celular) y la inhibición de GSK-3beta (estudios preclínicos), la cual es producida, asimismo, por agonistas de 5-HT1AR, 8-hidroxi-2-(di-n-propilamino)-tetralina (8-OH-DPAT).

En este tipo de estudios, se ha observado que los ISRS logran disminuir la concentración de la forma del péptido beta-amiloide (Abeta) que es nociva para las neuronas y, estimular la neurogénesis en el hipocampo y la producción de neurotrofinas, entre ellas, el factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF, brain-derived neurotrophic factor).

El objetivo del presente trabajo fue determinar la capacidad del escitalopram para reducir la hiperfosforilación de tau provocada por la forma Abeta1-42 y la implicancia de 5-HT1AR y Akt/GSK-3beta, en este proceso.

Métodos

Como modelo de estudio, se utilizaron las neuronas hipocampales derivadas de cerebros de embriones de ratas hembras de la cepa Sprague-Dawley, de día 18. Los cultivos primarios crecieron en medio Neurobasal, al cual se adicionó L-glutamina (0.5mM), suplemento B27 (2%) y antibióticos (penicilina y estreptomicina [20 UI/ml]), bajo condiciones de presión de CO2 del 5% y temperatura de 37°C, en un incubador humidificado.

En dichos cultivos neuronales (2 semanas de crecimiento con una pureza cercana al 95%), se indujo la hiperfosforilación de tau mediante la preparación Abeta1-42 (cúmulos de filamentos de oligómeros Abeta1-42) y fueron tratados de manera alternativa con escitalopram, R-citalopram, fluoxetina, 8-OH-DPAT, LY294002 y WAY-100635.

Los efectos exhibidos por estos tratamientos se evaluaron por medio de diversos procedimientos como inmunoelectrotransferencia(western blotting), para la detección de tau, GSK-3beta y Akt y, sus respectivas isoformas fosforiladas: pTau (en Ser [serina] 396 o Thr [treonina] 231), pGSK3-beta (en Ser 9) y pAkt (en Ser 473 o Thr 308).

En dicho procedimiento, las proteínas totales (20 ug), obtenidas a partir de lisados celulares, fueron separadas en geles de poliacrilamida y SDS y transferidas a membranas de PVDF. Estas membranas fueron incubadas con los anticuerpos primarios específicos y la detección de las distintas proteínas se llevó a cabo mediante la reacción del sustrato (ECL Western blotting reagents) con la enzima peroxidasa del rábano conjugada al anticuerpo secundario.

La concentración de las proteínas estudiadas se determinó por medio del programa informático, Quantity One. Asimismo, el efecto de los tratamientos en las espinas dendríticas y dendritas fue evaluado mediante inmunofluorescencia y la subsiguiente microscopía confocal (Olympus FV 1000).

En el análisis estadístico, se aplicaron análisis de varianza de una vía y la prueba de Tukey. Un valor de p < 0.05 determinó la significancia estadística.

Resultados

De acuerdo con las observaciones efectuadas mediante western blotting, el tratamiento de los cultivos neuronales con escitalopram (80 uM) o fluoxetina (20 uM) por un intervalo de 24 h permitió reducir la fosforilación de Tau en los sitios Ser 396 y Thr 231 y aumentar Tau1, la proteína no fosforilada, sin afectar la concentración de la proteína total.

La hiperfosforilación de tau fue inducida mediante tratamiento previo de las neuronas hipocampales, durante 4 h, con la preparación Abeta (1-42) (2 uM ), la cual contenía oligómeros de beta-amiloide, que por su peso molecular fueron considerados monómeros (4.5 kDa) y trímeros/tetrámeros (valor aproximado de 17 kDa).

Cabe destacar que la concentración de escitalopram utilizada no afectó la supervivencia neuronal y sus efectos se diferenciaron de su enantiómero, R-citalopram, el cual no afectó la hiperfosforilación de Tau inducida por Abeta (1-42).

Por otra parte, el inhibidor selectivo de PI3K, LY294002 (10 uM) contrarrestó los efectos provocados por el escitalopram (80 uM), es decir, suprimió la disminución en la fosforilación de Tau en Ser 396 y Thr 231, la inactivación (fosforilación en Ser 9) de GSK-3beta y la activación de Akt (fosforilación en Thr 308 y Ser 473).

En concordancia, el antagonista específico de 5-HT1AR, WAY-100635 (10 uM), exhibió una acción similar a LY294002, en los cambios provocados por el escitalopram en los estados de fosforilación de tau, GSK-3beta y Akt (verificado en Ser 473). En estos experimentos, LY294002 y WAY-100635 fueron agregados al medio de manera previa al antidepresivo: incubación de 2 y 1 h, respectivamente.

Es importante mencionar que el escitalopram no afectó la actividad de la fosfatasa 2A (PPA2), la cual desfosfosforila a tau (no se registraron cambios en la concentración de la forma inactiva, pY307-PP2A). Por otra parte, al igual que dicho ISRS, el agonista de 5-HT1AR, 8-OH-DPAT fue eficaz en reducir la hiperfosforilación de tau y aumentar la fosforilación de Akt y GSK-3beta, en los sitios evaluados (en ambos casos el efecto adquirió mayor significancia a concentraciones superiores del agonista: utilización de 5 a 80 uM [cultivos expuestos por 24 h]).

Con respecto al efecto del escitalopram en las dendritas, el fármaco logró contrarrestar la disminución en la densidad de espinas dendríticas, provocada por la exposición de los cultivos a la preparación Abeta (1-42) y aumentar la extensión de las dendritas primarias y la densidad de dendritas, parámetros cuyos valores habían sido reducidos por el tratamiento con los oligómeros de beta-amiloide (en estas evaluaciones el número de dendritas primarias no fue afectado).

En concordancia, el escitalopram permitió aumentar la expresión de los marcadores de sinapsis, PSD95 y sinaptofisina, a niveles controles observados en ausencia de las formas Abeta (1-42). Estos oligómeros indujeron la reducción en la expresión de dichos marcadores.

Discusión

En los cultivos primarios de neuronas hipocampales (modelo murino), el escitalopram y la actividad de la cascada de señalización mediada por 5-HT1AR permitieron disminuir, mediante la activación de Akt y la inhibición de GSK-3beta, la hiperfosforilación de tau provocada por los oligómeros(1-42) de beta-amiloide.

Asimismo, la fluoxetina fue eficaz en reducir esta hiperfosforilación y, en concordancia con estudios previos, en los que se utilizaron también otros ISRS (paroxetina, sertralina y escitalopram), efectuados en cerebros de rata, células madre neurales y neuronas hipocampales, produjo el aumento de la actividad de Akt, efectos que permiten postular la capacidad terapéutica de estos antidepresivos en el tratamiento de la EA.

Por otra parte, la actividad de 5-HT1AR parece ser fundamental para que el escitalopram reduzca los niveles de fosforilación de tau, ya que el antagonista del receptor suprime el efecto del fármaco.

Cabe destacar que la acción del escitalopram en presencia de Abeta(1-42) se observa a nivel de las estructuras celulares, debido a que este ISRS aumenta la densidad de espinas dendríticas y la extensión de dendritas y, en consecuencia, revierte el efecto de dichos oligómeros.

Sin embargo, es necesario efectuar estudios adicionales tendientes a determinar la implicancia de PI3K/Akt y GSK-3beta en los cambios inducidos por el escitalopram en dichas estructuras neuronales.

Conclusión

En el modelo murino de cultivos primarios de neuronas hipocampales, el escitalopram disminuye la hiperfosforilación de tau provocada por Abeta(1-42), mecanismo en el que se encuentran implicados 5-HT1AR y la cascada de señalización de Akt/GSK-3beta.

SIIC- Sociedad Iberoamericana de Información Científica