Introducción

La bronquiolitis (BQL) es una enfermedad de la vía aérea baja que afecta los bronquiolos de lactantes. Su causa es una infección viral, siendo el número de casos sin identificación etiológica cada vez menor. El virus sincicial respiratorio (VSR) es el agente más importante como causa de  hospitalización y es la principal causa de BQL en niños.

Contar con marcadores bioquímicos de la severidad de la enfermedad podría ayudar en el manejo inicial y decidir la hospitalización precoz de estos pacientes. La enzima láctico deshidrogenasa (LDH) podría ser un marcador apropiado dado su relación con la lesión tisular. La LDH es una proteína de membrana celular que forma parte de la oxidación de diversos sustratos. Está presente en la mayoría de los sistemas, y cuando se encuentra en el espacio extracelular indica daño celular e inflamación. La medición de LDH del líquido broncoalveolar se realiza comúnmente, como un equivalente de la presencia de leucocitos e inflamación en general. En pacientes con BQL por VSR los neutrófilos representan más del 90% del total de las células presentes en los lavados nasales y más del 70% en fluido broncoalveolar. La actividad de la LDH en lavado nasal y suero de niños con BQL aún no ha sido reportada.

Los autores postulan que la LDH podría tener una correlación directa con la respuesta inmune pro-inflamatoria observada en pacientes con bronquiolitis, y sería marcador útil de la gravedad de la enfermedad.

En un estudio previo se midió la LDH en lavado nasal y muestras de suero de una cohorte de niños con BQL. Los resultados mostraron mayores niveles de LDH en las formas de BQL menos severas, y podría ser un marcador pronóstico de la enfermedad. Estos hallazgos coinciden con otros resultados expuestos previamente por los autores dónde proponen los beneficios de una respuesta pro-inflamatoria adecuada para disminuir la gravedad de la BQL.

Objetivo: Evaluar si la LDH del lavado nasal es un indicador de la severidad de bronquiolitis.

Pacientes, material y método

Diseño del estudio
Estudio prospectivo sobre niños menores de 24 meses que consultaron al servicio de emergencias entre el 1 de noviembre de 2004 y 28 de febrero de 2005 con diagnóstico de BQL.

Los niños con dificultad respiratoria secundaria a causas no virales fueron excluidos. Se contó con la aprobación del comité de ética del Baylor College of Medicine y del Hospital de Niños de Texas.

Para la definición de BQL se utilizó la presencia de taquipnea, crepitaciones, sibilancias y / o retracciones (tiraje), y antecedentes de infección de vías aéreas superiores (congestión nasal y / o rinorrea) diagnosticados por el médico en el servicio de emergencias. La decisión de hospitalizar al niño estuvo a cargo del médico tratante.

Los signos de gravedad incluyeron requerimientos de oxígeno suplementario, hidratación endovenosa y / o requerimientos de intubación.

Obtención de muestras
Luego de la llegada al servicio de emergencias, tras la administración del consentimiento informado, se obtuvieron datos demográficos del paciente y se realizó el examen físico. Posteriormente se obtuvo una muestra de lavado nasal (mediante técnica previamente estandarizada). La muestras fueron guardadas a -70º C para su posterior procesamiento en forma conjunta.

Detección viral
La identificación viral se realizó mediante cultivo de tejidos, y reacción en cadena de polimerasa PCR.

Cuantificación de VSR
La concentración de VSR fue cuantificada por dos métodos. En primer lugar, todas las muestras positivas para VSR fueron valoradas por duplicado y consignadas como unidades formadoras de placas por mililitro (plaque-forming units per mililiter). En segundo lugar, todas las muestras fueron evaluadas por RCP en forma ciega al cultivo cuantitativo.

Determinación de citoquinas / quimoquinas
Los lavados nasales fueron estudiados para determinar el nivel de citoquinas y quimoquinas. El límite inferior de detección para ambas fue de 1 pg / ml. Según los autores este tipo de estudio ya había sido previamente reportado y validado.

Medición de proteínas totales
También fueron cuantificadas las proteínas totales en el lavado nasal. Los resultados se expresaron como µg / ml.

Determinación de enzima láctico deshidrogenasa
La actividad de LDH fue evaluada en lavado nasal y en suero, ambas muestras fueron diluidas en 1:1 y 1:20 en una solución buffer y posteriormente analizadas en forma pareada.

Cuantificación de la apoptosis
La liberación de LDH puede ser un marcador de destrucción celular producida por el virus o de la respuesta inmune del huésped, consecuencia de una apoptosis inducida por el virus o por la propia respuesta inmune. Para cuantificar la apoptosis en lavado nasal se utilizó el kit Caspase-Glo3/7 y se expresó en unidades de luminiscencia relativa (actividad de caspasa, “caspase activity”.

Análisis Estadístico

Las concentraciones de LDH y el nivel de actividad de casapasa se normalizaron usando un  logaritmo de base 10. Posteriormente se utilizaron la técnicas habitualmente usadas, prueba de t de Student y chi cuadrado, correlación de Pearson o Spearman según indicación. El nivel de significación se estableció en 0,05.

Para evaluar la asociación entre ingreso hospitalario (definido como una permanencia mayor de 24 horas) y las variables independientes estudiadas se procedió a una regresión logística, este modelo incluyó solo las variables que mostraron asociación significativa en el análisis univariado.

El modelo inicial incluyó edad (≤ 3 o > 3 meses), fiebre (si / no), hipoxia (si / no), necesidad de hidratación parenteral (si / no), y aislamiento viral (si / no). La concentración de LDH y actividad de caspasa fueron clasificados en cuartiles y dicotomizados para su inclusión en el modelo (≥ 75% o < 75%). Del modelo final fueron eliminadas las variables fiebre, aislamiento viral, y actividad de caspasa por no ajustar al modelo de normalidad.

Todos los análisis estadísticos se realizaron mediante Stata 10.0 para Windows
(Stata Corp, College Station, TX).

Resultados

Agentes etiológicos de la bronquiolitis en la población estudiada
Sobre 101 niños con BQL inicialmente incluidos, 2 fueron excluidos del análisis. Una muestra se perdió en el transporte al laboratorio, aunque se utilizó la información clínica. Se obtuvieron muestras para lavado nasal en 98 participantes. Los datos clínicos fueron evaluables en 97 pacientes con valores caspasa conocidos y en 94 pacientes con concentraciones de LDH conocidas.

La media de edad fue de 5,6 meses (rango: 0,46 -23,9), 64% fueron varones. De los pacientes estudiados, 46% tenía antecedentes familiares de asma, y 22% historia de eczema. La duración de la enfermedad tomada desde el momento de la presentación en el servicio de emergencias tuvo una mediana de 4 días (media 5,2 días ± 4,2).

La etiología viral específica fue determinada en el 83,6% de los pacientes. La infección por VSR fue la principal causa de BQL, presente en el 66,3% de los individuos. El segundo agente etiológico en frecuencia fue Rinovirus en el 19,4% los casos. Cabe destacar que el 16% de los pacientes tenían infecciones por dos virus distintos.

El análisis de subgrupos reveló 52 casos de VSR-A y 13 casos de VSR-B. No hubo diferencias en los niños con las cepas A o B con respecto a la hospitalización, necesidad de ventilación mecánica, requerimientos de oxígeno, o concentraciones medias de LDH en lavado nasal. La proporción de pacientes infectados por VSR fue comparable entre hospitalizados y aquellos manejados en forma ambulatoria.

Factores demográficos y clínicos
No se encontraron diferencias en las concentraciones de LDH según la edad, género, etnia, historia de atopía, exposición ambiental al tabaco, asistencia a guardería, o convivencia con niños pequeños. El aislamiento viral vs. no aislamiento se asoció con mayores concentraciones de LDH. Por su parte, los niños con rescate de VSR tuvieron mayores concentraciones de LDH respecto de aquellos con otros virus (2,15 vs. 1,58 p=0,001). 

Concentraciones de LDH, proteínas totales y correlación con VSR
Los niveles de LDH no difirieron según los grupos de edades. Tampoco se encontró correlación entre los niveles de LDH en lavado nasal y suero (Spearman 0,06, p=0,6)

Las pruebas in Vitro demostraron que el aumento de la replicación de VSR en células epiteliales del árbol respiratorio aumentaba las concentraciones de LDH. La correlación entre las concentraciones de LDH en el lavado nasal y la infección por VSR medida por actividad en placas no alcanzó significación estadística. Sin embargo, cuando se estudiaron sub-grupos mediante PCR para VSR tipo A se demostró una correlación de r = -0,48, p<0,001 y para VSR tipo B r = -0,62, p=0,015.

El contenido total de proteínas en el lavado nasal tuvo una correlación significativa con la concentración de LDH de la misma muestra (r=0,48 p<0,001).

Citocinas, quimiocinas y apoptosis
Los niveles de linfocitos T helper, interleukina 2, interferón gamma, otras citokinas y factores proinflamatorios tuvieron una fuerte correlación con LDH del lavado nasal. Se encontró una correlación positiva lineal entre los niveles de  LDH del lavado nasal y los niveles de caspasa (medidor de apoptosis) r=0,75 p<0,001.

Análisis de los indicadores de bronquiolitis grave
Los niños con bronquiolitis de manejo ambulatorio tuvieron niveles de LDH en lavado nasal significativamente menores en comparación con aquellos que debieron ser internados (1,85 vs. 2,36 U/ml p=0,002). La proporción de hospitalización fue del 82% en menores de 2 meses, del 71% en los niños de 3 a 5 meses, del 50% en pacientes de 6 a 11 meses, y en el 58% en los niños de 12 a 23 meses.

Cerca de la mitad de los pacientes que fueron hospitalizados tuvieron requerimientos de oxígeno suplementario. Los pacientes con oxígeno suplementario superior a 24 horas tuvieron menores niveles de LDH en el lavado nasal.

En el análisis multivariado para predecir hospitalización incluyó las variables fiebre, requerimiento de fluidos parenterales, rescate microbiológico, edad menor de 3 meses, concentración le LDH en el lavado nasal, actividad de caspasa, y requerimientos de oxígeno suplementario. Se observó que la edad menor de 3 meses y el requerimiento de oxígeno presentaron aproximadamente 5 veces más riesgo de hospitalización, mientras que niveles elevados de LDH en lavado nasal (>365 U/ml) se asoció con una disminución de la internación del 81% (p=0,01).

El modelo final mostró un área bajo la curva de 0,87. El modelo clasificó correctamente el 79,6% de las observaciones, 12 pacientes hubieran sido manejados en forma ambulatoria en forma incorrecta. La sensibilidad, especificidad, valor predictivo positivo y negativo fueron del 81%, 77%, 88% y 66% respectivamente.

Discusión

La presente corresponde a la primera descripción de las concentraciones de LDH en lavado nasal de niños con BQL. La LDH se mostró como marcador bioquímico independiente para disminuir el número de internaciones por esta patología. Los autores observaron mayores niveles de LDH en pacientes manejados en forma ambulatoria en comparación con aquellos internados por BQL (p<0,002), y además, se observó una buena correlación con los marcadores de apoptosis (caspasa 3/7) y con citoquinas implicadas en la respuesta inmune.

El aislamiento viral se asoció con mayores niveles de LDH, sin emabrago, es de destacar que los niveles de LDH del lavado nasal y del suero no guardaron correlación, hecho que sugiere que la LDH tiene su origen en las vías respiratorias (células del epitelio que sufrieron apoptosis) y tiene escaso pasaje a sangre. Por su parte, la buena correlación observada entre niveles de LDH e IL8, así como con caspasa 3/7 sugieren que el origen probable de LDH sea de la apoptosis del epitelio respiratorio.

El VSR es el agente etiológico más frecuente en BQL, y en el presente estudio también refleja este dato. El 66% de los casos estuvieron asociados a VSR. Es razonable pensar que mayor concentración viral pueda estar asociada con un curso más severo de la enfermedad. Los estudios previos al respecto son dispares, por un lado algunos demostraron mayores niveles en pacientes que requirieron ventilación asistida en comparación con aquellos que solo necesitaron internación en sala común, mientras que otros estudios no pudieron demostrar diferencias.

Hasta el momento de la publicación del presente trabajo no ha habido trabajos sobre el valor predictivo de marcadores bioquímicos en niños con BQL. La sensibilidad y especificidad observada en el trabajo fue de 81% y 77% respectivamente. Estos valores son comparables a los de otros tipos de pruebas utilizadas. Por otra parte, la evaluación de la LDH en el lavado nasal es sencilla de realizar. Actualmente, la hipoxemia, el grado de dificultad respiratoria y el juicio clínico son los principales elementos para determinar la internación de un paciente con BQL. Contar con un método bioquímico validado para predecir la internación de un paciente sería un elemento más de ayuda en el manejo de esta patología.

Conclusiones

La determinación de LDH en lavado nasal podría ser un marcador útil para evaluar la severidad de pacientes con BQL.

Serán necesarios estudios de validación de los resultados observados para una posterior utilización en la toma de decisiones clínicas.
 
Comentario

Todo elemento de predicción se propone con el objetivo de integrar en un futuro un elemento o parte de una regla de decisión. En este trabajo los autores proponen medir los niveles de LDH en el lavado nasal como elemento de predicción de la severidad de la BQL en niños.

Escapa al objetivo y al diseño la comparación con otras formas de predicción como la valoración clínica y los requerimientos de oxígeno.

Técnica y metodológicamente el estudio es correcto, y con un importante control de las variables. Lamentablemente, la sensibilidad de la prueba (concentración de LDH) fue de 81%, si bien el valor no es malo, significa que existiría un 19% de pacientes graves o con enfermedad severa no identificados por la prueba. Creo que sería más apropiado, aunque se obtenga una menor especificidad, contar con un punto de corte que identifique severidad con un 100% de sensibilidad.

En coincidencia con los autores, este es el primer estudio de medición de LDH como predictor, se necesitan más estudios al respecto.

♦ Traducción objetiva y comentario: Fernando Torres