En la anemia aplástica, la médula ósea contiene muy pocas células hematopoyéticas y abundante grasa. La enfermedad puede ser adquirida o constitucional. En la mayoría de los casos adquiridos, el tejido hematopoyético es el blanco de un proceso inmunológico dominado por la expansión oligoclonal de las células T citotóxicas de tipo I, las cuales segregan interferón-a y el factor de necrosis tumoral a, y causa la muerte celular por apoptosis. La anemia aplástica adquirida puede ser tratada con buen resultado mediante el trasplante alogénico de médula ósea o el tratamiento inmunosupresor.
La anemia de Fanconi y la disqueratosis congénita son los tipos más comunes de anemia aplástica constitucional (congénita). La disqueratosis congénita ligada a X está causada por mutaciones en el gen DKC1, el cual codifica la disquerina, una partícula ribonucleoproteica nucleolar pequeña que se asocia con el complejo telomerasa. El compromiso de este gen ha implicado al complejo de reparación del telómero en la fisiopatología de la disqueratosis congénita; en realidad, las células de los pacientes con esta enfermedad tienen telómeros muy cortos y escasa actividad de la telomoerasa. Luego, en la forma autosómica dominante de la disqueratosis congénita se identificaron mutaciones del gen TERC, el cual codifica el componente del RNA del complejo telomerasa.
Los telómeros son elementos estructurales que cierran los extremos de los cromosomas, protegiéndolos de la recombinación, la fusión terminoterminal y el reconocimiento del DNA dañado. En las células somáticas de los seres humanos, los telómeros están compuestos por más de 1000 repeticiones en tandem de nucleótidos (CCCTAA en una hebra de DNA y TTAGGG en otra), asociados a proteínas. Estas repeticiones se van perdiendo en forma gradual con la replicación celular y el envejecimiento, por la incapacidad de la polimerasa del DNA de replicar por completo el extremo 3´ del DNA. El desgaste de las repeticiones finalmente acorta mucho los telómeros, provocando la detención de la proliferación y la senescencia y menor expectativa de vida, apoptosis o inestabilidad genómica celulares. El mantenimiento de la integridad de los telómeros requiere del complejo ribonucleoproteina telomerasa, el cual consiste en la transcriptasa reversa de la telomerasa (TERT) y su templete RNA integral (TERC), además de otras proteínas.
El TERT copia una región corta del TERC en el DNA telomérico para extender el extremo 3´ del cromosoma.
Los autores de este y otros trabajos han comprobado que los telómeros de los leucocitos de aproximadamente un tercio de los pacientes con anemia aplástica adquirida son cortos, en especial en aquellos que no responden al tratamiento inmunosupresor. Por esta razón, los autores investigaron la evidencia de disqueratosis congénita críptica y las mutaciones del TERC en la anemia aplástica. De este modo descubrieron dos familias en las cuales cada probando tenía anemia aplástica. Las mutaciones TERC estaban presentes en los pacientes graves y en muchos miembros de la familia, pero sin estigmas físicos de disqueratosis congénita (pigmentación cutánea anormal, distrofia ungular y leucoplaquia mucosa). Sin embargo, debido a que las mutaciones TERC son infrecuentes en la anemia aplástica adquirida, los autores postulan que las mutaciones de los genes correspondientes a otros componentes del complejo ribonucleoproteina telomerasa podrían contribuir con la insuficiencia de la médula ósea.
Métodos
Se hizo el screening de las células sanguíneas o medulares de 124 pacientes con anemia aplástica adquirida y 282 sujetos control, con el fin de hacer la secuencia de las variaciones en los genes TERT, DKC1, NHP2 y NOP10. Además, se investigaron las variaciones genéticas del TERT en otros 81 pacientes y 246 controles adicionales. En los pacientes en quienes se hallaron variantes genéticas se evaluaron la longitud del telómero y la actividad de la telomerasa de los leucocitos de la sangre periférica. Las mutaciones identificadas fueron transfectadas a las líneas celulares con deficiencia de telomerasa con el fin de examinar sus efectos y su mecanismo de acción sobre la función de la telomerasa.
Resultados
En el TERT, el gen de la enzima catalítica transcriptasa reversa de la telomerasa, de siete pacientes no relacionados, se identificaron cinco mutaciones heterocigotas no sinónimas (las cuales causan una alteración en el aminoácido de la proteína correspondiente). Los leucocitos de esos pacientes tenían telómeros cortos y una actividad enzimática de la telomerasa disminuida. En tres de esos pacientes, la mutación también fue detectada en las células de la mucosa bucal. Los miembros de la familia portadores de las mutaciones también tenían telómeros cortos y actividad de la telomerasa reducida pero sin evidencia de anormalidad hematológica.
Los resultados de la coexpresión del TERT de tipo libre o salvaje (wild) y del TERT con mutaciones asociadas a la anemia aplástica en las células deficientes de telomerasa indicaron que el mecanismo de acortamiento telomérico derivado de las mutaciones del TERT fue la haploinsuficiencia.
Discusión
En este estudio, los autores hallaron mutaciones no sinónimas en el gen TERT, el cual codifica la transcriptasa reversa de la telomerasa, en pacientes con anemia aplástica adquirida. La importancia funcional de esas mutaciones está indicada por su asociación con telómeros muy cortos y actividad reducida de la telomerasa en los cultivos primarios de los leucocitos de los pacientes. En los experimentos con cultivos de células, las mutaciones del TERT asociadas con la anemia aplástica provocaron una disminución de la actividad de la telomerasa por un mecanismo de haploinsuficiencia: es decir, el alelo normal remanente fue insuficiente para producir una cantidad adecuada de la enzima.
Los autores identificaron mutaciones en los tres dominios de la proteína TERT: los dominios terminales N y C específicos de la telomerasa y el dominio de la transcriptasa reversa conservado. Los cultivos primarios de leucocitos de los pacientes y sus familiares portadores de mutaciones del TERT mostraban una actividad enzimática de la telomerasa más baja que en los cultivos de leucocitos de las personas sanas. Cuando los vectores cotransfectados conteniendo TERT del tipo salvaje y TERT con mutaciones individuales en la línea celular telomerasa negativa, la actividad de la telomerasa de las formas mutadas de las proteínas TERT estuvo reducida solo en forma parcial, indicando que esas mutaciones pueden actuar por haploinsuficiencia y no por un mecanismo negativo dominante verdadero. La haploinsuficiencia también es el mecanismo principal por las mutaciones del TERC asociadas a la disqueratosis congénita y la anemia aplástica disminuyen la actividad de la telomerasa. En general, dicen los autores, una disminución del 50% de la expresión de la enzima en heterocigotas no influye en el fenotipo, pero la expresión del complejo telomerasas está estrechamente regulado, y una reducción parcial en su actividad es suficiente para alterar el mantenimiento de la longitud del telómero.
Los investigadores afirman que los datos obtenidos también coinciden con un efecto de la deleción del gen TERT con el síndrome del "cri du chat," en el cual las porciones distales del cromosoma 5p en uno de los alelos, incluyendo toda la región de codificación del gen TERT, sufren la deleción. En algunos pacientes con síndrome "cri du chat," se han observado la reducción de la expresión del TERT y de la actividad de la telomerasa, indicando que en este síndrome el mecanismo de acción también es la haploinsuficiencia.
Dado que los pacientes con anemia aplástica y mutaciones del TERT no presentan anormalidades físicas, la deleción del TERT sola no sería la responsable del todo el fenotipo del síndrome del "cri du chat." El hecho que los pacientes con este síndrome no tengan insuficiencia de la médula ósea podría ser explicado por "la anticipación de la enfermedad", como ocurre en la disqueratosis congénita: en esa afección, los síntomas y los signos se hacen aparentes a edad cada vez menor en la generaciones sucesivas, y el acortamiento del telómero progresa en varias generaciones.
Las alteraciones de los nucleótidos en el gen DKC1 y algunas mutaciones localizadas en le región 3´ del TERC en la posición H/ACA y el dominio CR7 provocan la disqueratosis congénita, acompañada de pancitopenia en las primeras décadas de la vida y asociadas a anomalías físicas. Las mutaciones en la región 5´ del TERC (en el denominado seudonudo y dominios CR4-CR5) y el TERT se asocian con más frecuencia con la anemia aplástica en edades más tardías y no están usualmente relacionadas con los estigmas físicos de la disqueratosis congénita. El TERT y la región 5´ del TERC se necesitan para la actividad enzimática y de la telomerasa y para ensamblarse con el complejo ribonucleoproteico telomerasa, mientras que las proteínas relacionadas con H/ACA (disquerina, NOP10 y NHP2) y la región 3´ del TERC afectan la estabilidad del complejo y sus mutaciones.
De acuerdo con los autores, la mayoría delos pacientes debería ser estudiada genéticamente para determinar si existe una asociación entre el fenotipo de la enfermedad (por ej., gravedad de la pancitopenia, edad del comienzo de las manifestaciones clínicas y las anomalías físicas) y la localización de las lesiones genéticas en las regiones específicas de la actividad funcional en los genes que codifican el complejo de reparación telomérica. El RNA nucleolar pequeño con el motivo del box H/ACA participa en la seudouridilación del RNA ribosómico y otros RNA pequeños, pero no existen datos que indiquen que el TERC RNA o la transcriptasa reversa de la telomerasa también represente un papel en la modificación postranscripcional del RNA ribosómico.
Aunque el número de pacientes de su estudio es demasiado pequeño, los autores sostienen que les ha permitido llegar a una conclusión definitiva, y es que ninguno de los pacientes con mutaciones TERT respondieron al tratamiento inmunosupresor. En otras series realizadas por estos mismos autores, los pacientes con mutaciones TERC tampoco tuvieron una respuesta adecuada a la inmunosupresión. Es posible, dicen, que las mutaciones específicas en uno o más genes podrían influir en la elección del tratamiento-la elección de regímenes farmacológicos específicos o la decisión de hacer un trasplante de células madre. Por esta razón, acotan, las mediciones de la longitud del telómero en los leucocitos sanguíneos y las pruebas genéticas para buscar mutaciones génicas de la telomerasas podrías ser útiles para el manejo de la anemia aplástica adquirida
Es de destacar, prosiguen, que los seres humanos con actividad deficiente de la telomerasa, igual que los ratones de experimentación, pueden tener un fenotipo normal y anormalidades hematológicas mínimas o inaparentes. Sin embargo, debido a que la capacidad proliferativa hematopoyética es limitada, las personas y los animales afectados pueden tener una susceptibilidad especial a los insultos ambientales hacia la médula ósea (fármacos, virus) y el menor número de células pluripotenciales en los pacientes puede limitar su respuesta a los tratamientos inmunosupresores. Ciertos antígenos de histocompatibilidad y polimorfismos genéticos de las citocinas son más prevalentes en los síndromes de insuficiencia de la médula ósea mediados por procesos inmunológicos, estas características inmunológicas determinadas genéticamente afectan el reconocimiento de los antígenos específicos y la naturaleza de la respuesta inmune.
Para las células hematopoyéticas blanco, las mutaciones TERC y TERT brindan aparte una explicación genética para la anemia aplástica rara, idiosincrásica. Se podrían buscar variantes genéticas adicionales con el fin de caracterizas posibles modificadores de la evolución y explicar las diferencias en el momento del diagnóstico como así la penetrancia de la enfermedad. Las mutaciones genéticas del complejo de reparación telomérica reducen el tamaño del compartimiento de células pluripotenciales hematopoyéticas y la capacidad regenerativa de la médula ósea, haciendo que los pacientes con mutaciones genéticas se tornen susceptibles al desarrollo de una insuficiencia medular y afectando el curso de la anemia aplástica, una vez que ésta se manifiesta.
Las mutaciones TERT y TERC puede ser consideradas factores de riesgo genético de insuficiencia hematopoyética en los seres humanos. La dificultad para mantener la longitud del telómero provoca una reducción del compartimiento de células pluripotenciales hematopoyéticas, el cual puede quedar especialmente vulnerable a los insultos ambientales.