La definición de urocultivo positivo ha sido objeto de controversia durante décadas. Usar un límite de 100 000 unidades formadoras de colonias por mililitro (UFC/mL) para definir la infección del tracto urinario (ITU) en pacientes adultos estuvo basado en gran medida en un pequeño estudio de casos y controles informado por Kass¹ en 1956 en el que comparó los resultados del urocultivo de mujeres con pielonefritis clínicamente diagnosticada y controles asintomáticos; la mayoría de las mujeres con pielonefritis tenían recuentos de colonias superiores a 100 000 UFC/mL y la mayoría de las mujeres asintomáticas tenían recuentos de colonias inferiores a 10 000 UFC/mL.

Casi 30 años después, en un estudio transversal de niños pequeños que se sometieron a cateterismo vesical para descartar ITU, Hoberman y colaboradores compararon las características de los niños que tuvieron un crecimiento de 10 000 a 49 000 UFC/mL y 50 000 a 99 000 UFC/mL.² Entre las 35 muestras con crecimiento entre 10 000 y 99 000 UFC/mL, se observó crecimiento mixto y/o cocos Gram positivos más frecuentemente entre niños con recuentos de colonias de 10.000 a 49000 UFC/mL en comparación con niños con recuentos de colonias de 50000 a 99000 UFC/mL.

Desde entonces, el límite de 50.000 ha sido el punto de corte aceptado para la interpretación de los resultados de los cultivos de muestras recolectadas mediante cateterismo en niños menores de 2 años de edad.³ Sin embargo, debido a que no se utilizó un estándar de referencia independiente del cultivo en ninguno de estos 2 estudios, solo pueden considerarse como aclaratorio⁴ y no puede proporcionar más que aproximaciones de un límite que podría resultar útil en la práctica clínica.

De hecho, ha habido informes de problemas con el límite pediátrico actualmente aceptado de 50.000 UFC/mL. Un ejemplo notable proviene de un estudio de Swerkersson y colaboradores ⁵ en el que una proporción considerable de niños pequeños con pielonefritis confirmada radiológicamente tenían recuentos de colonias por debajo del límite actualmente aceptado de 50 000 UFC/mL.

Para investigar las compensaciones entre sensibilidad y especificidad en varios puntos de corte, se necesita un estudio transversal en el que se realiza tanto un urocultivo (la prueba índice) como un estándar de referencia independiente del cultivo en muestras no seleccionadas de sujetos en quienes es clínicamente sensato sospechar una ITU.

Avances recientes en la secuenciación 16S, que utiliza la secuencia exacta del altamente conservado Gen 16S del ARN ribosomal (ARNr) para identificar las bacterias presentes en las muestras, nos proporciona ahora un estándar de referencia sensible y relativamente imparcial para la identificación de organismos en la orina.

En un estudio anterior, encontraron una alta concordancia entre la secuenciación del amplicón del gen 16S ARNr (en lo sucesivo denominada secuenciación 16S) del urocultivo convencional en una cohorte de niños pequeños (no superpuesta con la cohorte actual) que se están evaluando para detectar ITU.⁶

En esta cohorte de niños pequeños y febriles sometidos a un cateterismo vesical para descartar una infección urinaria, mediante secuenciación 16S como estándar de referencia, los autores calcularon la precisión del cultivo convencional en diferentes puntos de corte para identificar el que proporciona el equilibrio óptimo entre sensibilidad y especificidad.

Entre junio de 2019 y mayo de 2020, inscribieron a niños consecutivos que acudieron al departamento de emergencias en el Hospital de Niños de Pittsburgh que tenían orina restante después de completar todas las pruebas clínicas. El estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Pittsburgh.

Se incluyeron niños si tenían entre 1 mes y 2 años y 11 meses de edad, tuvieron fiebre (temperatura documentada ≥38°C en el departamento de emergencias o por informe de los padres) dentro de las 24 horas de presentación y se le tomó una muestra de orina mediante catéter para descartar una ITU.

Excluyeron a los recién nacidos porque este estudio es parte de un estudio más amplio que examina los biomarcadores de pielonefritis. El diagnóstico de pielonefritis se logra mediante la realización de una gammagrafía renal, que es difícil de realizar en neonatos.

Los niños fueron excluidos si habían recibido antibióticos sistémicos o corticosteroides dentro de los 3 días anteriores a la inscripción, tuvieron otras infecciones bacterianas sistémicas concurrentes, eran inmunodeficientes, tenían vejiga neurogénica o tenían anomalías genitourinarias importantes (p. ej., espina bífida, riñones displásicos, reflujo vesicoureteral de grado IV o IV).

El urocultivo convencional se realizó en el laboratorio microbiológico clínico del hospital que utiliza métodos microbiológicos estándar y el número de unidades formadoras de colonias (UFC)/mL se informaron como <10 000, 10 000 a 49 000, 50 000 a 99 000 y ≥100 000.

> Procesamiento de muestras de orina para secuenciación 16S

Se utilizó una alícuota de orina residual para la secuenciación 16S. La alícuota generalmente se produjo dentro de 1 hora de la recolección; sin embargo, si se anticipaban retrasos, las muestras se mantenían refrigeradas.

La alícuota se congeló en un criovial a -80°C sin conservantes. Antes del envío, agregaron 70 µLs de buffer acondicionador de orina (Zymo, D3061-1-8) por cada 1 ml de muestra de orina congelada. Las muestras se enviaron durante la noche en un paquete frío al Laboratorio Pangea, Tustin, CA, EE. UU., para el análisis de secuenciación 16S mediante la Prueba Microbiana PrecisionBIOME NGS.

El ADN se extrajo del espécimen urinario usando el Kit ZymoBIOMICS DNA Miniprep según las instrucciones del fabricante (Zymo Research Corporation, Irvine, CA). El ADN extraído se preparó para el análisis del microbioma siguiendo el flujo de trabajo PrecisionBIOME, que incluyó la preparación de la biblioteca utilizando el kit de preparación Quick-16S NGS (regiones V1-3, Zymo Research Corporation, Irvine, CA), secuenciación de amplicones con códigos de barras con la plataforma de secuenciación MiSeq (Illumina, San Diego, CA) y análisis bioinformático utilizando la pipeta bioinformática PrecisionBIOME capaz de producir resolución a nivel de especies de secuencias bacterianas y fúngicas (los datos sobre hongos presentes y las citocinas se informarán por separado).

Se incluyeron controles negativos (medio de transporte solo e hisopos no utilizados). Para controlar la contaminación, también incluyeron células y comunidades simuladas de ADN como controles positivos. Posibles errores de secuenciación y las secuencias quiméricas se eliminaron con la pipeta DADA2.

> Procesamiento de datos de secuenciación 16S

Usaron Uclust para realizar clasificaciones taxonómicas utilizando una base de datos personalizada de PrecisionBIOME. Calcularon los filotipos como proporciones porcentuales basadas en el número total de secuencias en cada muestra.

La resolución a nivel de especie de este enfoque de secuenciación fue confirmada previamente mediante secuenciación de escopeta.⁷ Excluyeron muestras con <1000 secuencias por muestra.

> Condición objetivo que se está diagnosticando

En un estudio previo realizado entre 2011 y 2017,⁶ los autores encontraron una alta tasa de concordancia entre los urocultivos convencionales y la secuenciación 16S en la identificación de bacterias en la orina. Esto establecido, los autores sintieron que ahora era apropiado en el contexto de este estudio exploratorio, sustituir la secuenciación 16S en lugar del urocultivo en el diagnóstico de ITU (la afección objetivo).

En la práctica clínica, además de la presencia de bacteriuria en el cultivo, se requiere la elevación de marcadores de inflamación para diagnosticar ITU.³

En consecuencia, para diagnosticar la ITU en el contexto de este estudio de prueba de concepto, además de requerir que ≥80% de las secuencias pertenecieran a un solo taxón (es decir, abundancia relativa de cualquier taxón ≥80%), también requieren la elevación de los marcadores urinarios de inflamación.

En la construcción de su referencia estándar, los autores eligieron un límite del 80% (para el análisis primario) porque sintieron que, como médicos, se verían obligados a diagnosticar una ITU en un niño febril con marcadores urinarios de inflamación cuya orina tenía este nivel de bacteriuria.

El resto de los niños fueron clasificados como “ninguna ITU”. Como análisis de sensibilidad, también examinaron resultados utilizando límites de abundancia relativa del 50% y 90%.

> Marcadores urinarios de inflamación

A cada niño se le realizó un análisis microscópico de orina en el que se observaron glóbulos blancos (GBs) (por milímetro cúbico o por campo de alta potencia) y una prueba con tira reactiva medidora en la que se informa la prueba de esterasa leucocitaria de forma semicuantitativa (ninguno, trazo, 1+, 2+, 3+).

Debido a que la sensibilidad de ambas pruebas de GBs y esterasa leucocitaria es generalmente baja,⁸ también midieron, utilizando métodos utilizados en estudios anteriores, ⁹ lipocalina asociada a gelatinasa de neutrófilos (LAGN) en una alícuota de orina residual.

LAGN es un marcador inflamatorio liberado por neutrófilos o por células intercaladas en el riñón en respuesta a la ITU.^9,10 Aunque el uso de LAGN urinaria para el diagnóstico de ITU es un desarrollo relativamente reciente, dada la sólida evidencia que respalda su uso para diagnosticar ITU,¹⁰ los autores decidieron, a priori, categorizar a un niño con evidencia de inflamación si alguno de los siguientes estaba presente: ≥10 GB/mm³, ≥5 GB por campo de alta potencia (Hpf), ≥ traza de esterasa leucocitaria o nivel LAGN superior a 39,9 ng/mL.¹⁰ Realizaron un análisis de sensibilidad examinando los resultados si no hubieran considerado a LAGN como un marcador de inflamación.

> Prueba de índice en evaluación

Los autores definieron los resultados del cultivo convencional como positivos si el urocultivo presentaba un crecimiento de al menos 1 organismo con un recuento de al menos 10 000 UFC/mL y si al menos 1 de los marcadores urinarios de inflamación estaba elevado. Otros puntos de corte evaluados fueron 50 000 UFC/mL y 100 000 UFC/mL.

> Análisis estadístico

Para el análisis primario, calcularon la sensibilidad y especificidad del urocultivo para detectar ITU (utilizando un valor relativo corte de abundancia del 90% en un niño con marcadores urinarios de inflamación), junto con los correspondientes intervalos de confianza de Wald del 95%. Luego repitieron los análisis utilizando diferentes definiciones de ITU (es decir, utilizando límites de abundancia relativa del 50% y del 80% en lugar del 90%). Resumieron y analizaron los datos utilizando SAS versión 9.4 (SAS Institute Inc).

En total, se incluyeron en el estudio 341 niños. La mayoría de los niños matriculados eran mujeres (74%), blancos (67%) y la mayoría (64%) tenía una temperatura documentada de 39 °C o más. La edad media de los niños en el momento del diagnóstico fue de 12,5 meses y la temperatura media en la presentación era 39,3 °C. En niños con marcadores urinarios de inflamación, pero sin al menos 1 organismo con un recuento de 10 000 UFC/mL o más en el cultivo, la abundancia relativa mediana de los organismos predominantes identificables fue del 15% (rango intercuartil: 7%–32%).

Utilizando un límite de corte de abundancia relativa del 80%, 46 niños en esta muestra tuvieron una ITU. De estos, 41 (89%) tenían E. coli como patógeno predominante. Cuando se utiliza un límite ≥10 000 para definir un urocultivo positivo, entre 46 niños con ITU, 45 fueron identificados correctamente por urocultivo convencional (sensibilidad del 98%, intervalo de confianza [IC]: 93% al 100%).

El niño que se perdió fue un bebé de 4 meses con esterasa leucocitaria 3+ en tira reactiva, un recuento de GB de 73 por Hpf, un LAGN elevado de 319, en quienes se identificaron >99% de secuencias mediante secuenciación 16S asignada a especies de Klebsiella. En el cultivo, este niño tenía <10 000 UFC/ml de gérmenes gramnegativos y <10 000 UFC de cocos grampositivos; no se identificó ningún organismo más debido al bajo recuento de colonias. De los 295 niños sin ITU, 291 fueron identificados correctamente como tal mediante cultivo convencional (especificidad del 99%, IC: 97% a 100%).

El uso de un límite de ≥50 000 UFC/ml disminuyó la sensibilidad del urocultivo al 80% (IC 95%: 68%–93%). El cambio en el límite a 50 000 tuvo un efecto insignificante sobre la especificidad (es decir, la especificidad se mantuvo en 99%, IC: 98%-100%). Los 8 niños extra con ITU que se habrían pasado por alto si se hubiera fijado un límite de 50 000 utilizado; todos los niños con ITUs perdidas tenían organismos actualmente considerados uropatógenos, y, por definición, todos eran sintomáticos y tenían niveles elevados de marcadores urinarios de inflamación.

El uso de un punto de corte de 100 000 UFC/mL habría reducido la sensibilidad al 70% (IC 95%: 55%-84%). Los cambios en la definición del estándar de referencia tenían poco efecto sobre las estimaciones de precisión.

La sensibilidad y las estimaciones de especificidad habrían sido similares si no incluyeran LAGN como marcador de inflamación.

Estudios anteriores han intentado comprender los resultados de los urocultivos comparando recuentos de colonias en condiciones extremas (es decir, pielonefritis versus asintomáticos) ¹ o por comparar las características de los sujetos con ciertos límites altos y bajos de recuento de colonias.²

Dichos diseños de estudio, aunque necesarios durante las primeras fases exploratorias de investigación sobre pruebas de diagnóstico, no pueden proporcionar una evaluación verdadera de la precisión de una prueba en la práctica clínica, ni se pueden utilizar para identificar puntos de corte que optimicen la sensibilidad y la especificidad. ⁴

Aquí, utilizando la secuenciación 16S como método estándar de referencia para el diagnóstico de ITU, los autores fueron capaces de evaluar la precisión diagnóstica del urocultivo en varios límites de recuento de colonias.

Encontraron que, en casos de niños febriles menores de 3 años sometidos a cateterismo vesical para descartar ITU, utilizando un recuento de colonias de 10 000 UFC/ml habría dado lugar a menos casos de ITU omitidos que usar un recuento de colonias de 50 000 UFC/mL (omite el 20% de los casos) o 100 000 UFC/ml (omite el 30% de los casos).

Según el diseño del estudio, todos los niños con ITU omitida tenían marcadores urinarios elevados de inflamación y eran febriles. En consecuencia, los datos sugieren que un límite de 10 000 UFC/mL diferencia mejor a los niños pequeños con y sin una ITU auténtica.

Hay muchas razones por las que la secuenciación 16S, especialmente cuando se combina con marcadores urinarios de inflamación, es un estándar de referencia adecuado para el diagnóstico de ITU.

En primer lugar, a diferencia del urocultivo, que está optimizado para detectar E. coli, ¹¹ el análisis de secuenciación 16S proporciona una evaluación en gran medida imparcial de las bacterias presentes en la orina. De hecho, un creciente cuerpo de evidencia^12,13 sugiere que los resultados del análisis de secuenciación 16S se alinea bien con los resultados del urocultivo cuantitativo ampliado, una variación más sensible del urocultivo que utiliza medios de cultivo adicionales, mayores volúmenes de orina para inocular placas de cultivo, tiempos de incubación más prolongados y una variedad de condiciones atmosféricas.^14,15

Sin embargo, aunque los datos sobre la mayor sensibilidad de la secuenciación 16S en comparación con el urocultivo parece indiscutible, su mayor sensibilidad podría en teoría ser a costa de una menor especificidad, especialmente debido al paso de amplificación requerido. De este modo, uno podría imaginar un escenario en el que muchos organismos no relevantes clínicamente podrían identificarse mediante la secuenciación 16S, lo que lleva a un gran número de diagnósticos inapropiados de ITU.

En este estudio, sin embargo, el uso de la secuenciación 16S (junto con marcadores de inflamación) reveló únicamente 1 niño en el que se pasó por alto la ITU. Esto sugiere que el análisis de secuenciación 16S (en un umbral de abundancia relativa de 80%) combinado con marcadores inflamatorios de inflamación, fue un estándar de referencia adecuado para usar en este estudio.

Cuando comenzaron este estudio, los autores estaban preocupados por usar una medida relativa de abundancia como referencia estándar. Sin embargo, los resultados (en este estudio y en el anterior) muestran que, para el diagnóstico de ITU, la abundancia relativa de la secuenciación de 16S y los resultados absolutos del cultivo fueron sorprendentemente similares.

Los autores plantearon la hipótesis de que un patógeno como E. coli represente el 80% o más de todas las lecturas de muestra en la secuenciación 16S, el número de copias de su gen tienen que exceder los recuentos combinados¹⁶ de todas las demás bacterias normalmente presentes como parte del urobioma por cuatro. Así, el umbral de abundancia relativo del 80% sólo se alcanzará cuando la abundancia absoluta de un uropatógeno es bastante alta.

Los resultados respaldan el uso continuo del urocultivo (al menos un límite de 10 000 UFC/mL) en la población estudiada. Sin embargo, debido a los continuos avances tecnológicos en la precisión, velocidad y costo de la secuenciación 16S, es posible que pronto esté disponible en los centros clínicos. Si esto ocurre, la identificación de organismos podría lograrse en cuestión de horas en lugar de días. Por lo tanto, es importante que se realicen estudios de comparación para establecer los pros y los contras del uso de esta tecnología en el entorno clínico.

Es necesario considerar varias limitaciones de este estudio. Utilizaron una definición de ITU que requería la presencia de síntomas, marcadores urinarios elevados de inflamación y una alta abundancia relativa de organismos en el análisis de secuenciación 16S. Usar una definición menos estricta (por ejemplo, no exigir marcadores urinarios de inflamación) podría haber llevado a una mayor tasa de ITU no detectadas, pero habrían estado menos seguros que todas estas ITUs representaban ITUs de buena fe.

La elección de 80% para el umbral de abundancia relativa requerido para definir ITU, aunque basada en datos de un estudio anterior de los autores fue, sin embargo, hasta cierto punto, arbitraria. Reconocen que los organismos menos abundantes también pueden ser capaces de causar enfermedades importantes.

En definitiva, como lo demuestra el análisis de sensibilidad, el punto de corte elegido para el análisis primario tuvo poca influencia en las conclusiones. Esto probablemente se debe a que, en la mayoría de los casos, las muestras estaban dominadas por secuencias de un único uropatógeno conocido o tenían una abundancia muy baja de una variedad de organismos que, en estudios anteriores, se habían detectado en muestras de orina de personas asintomáticas.¹⁴

Los hallazgos solo se aplican directamente a niños a quienes se les realiza un cateterismo vesical para descartar ITU; puede ser necesario un límite más alto para el urocultivo si hay más contaminación, por ejemplo relacionada con el método de recolección. Los autores no usaron conservantes antes de congelar las muestras; sin embargo, las muestras nunca se dejaron a temperatura ambiente, y los resultados no sugieren sesgo debido al enfoque que utilizaron.

El laboratorio clínico no informó recuentos exactos de colonias para los urocultivos convencionales; esto podría haber sido útil para localizar el umbral de recuento inferior a 50 000 UFC/mL que mejor optimizó la sensibilidad y especificidad del urocultivo. La mayoría de las ITUs en esta muestra fueron causadas por E. coli.

Se necesitan estudios más amplios para examinar más a fondo la precisión de los umbrales de recuento de colonias para uropatógenos menos comunes.

Finalmente, la secuenciación 16S, aunque menos sesgada que el urocultivo, puede estar sujeta a ciertos sesgos, especialmente cuando la biomasa en las muestras es relativamente baja¹⁷; sin embargo, es poco probable que estos sesgos cambien el patrón observado de uno en el que muchos organismos están presentes en abundancias relativamente bajas de aquel en el que la muestra está dominada por 1 organismo.

Las fortalezas del estudio incluyeron la inscripción consecutiva de niños sintomáticos con sospecha de ITU, el uso de un estándar de referencia basado en datos anteriores, el rendimiento de la prueba índice y el estándar de referencia en todos los niños incluidos, el uso de definiciones clínicas a priori, el uso de controles positivos y negativos durante la extracción y secuenciación, y el uso de un enfoque de secuenciación validada.

Inevitablemente, reducir el límite para el diagnóstico de ITU, de 50 000 UFC/mL a 10 000 UFC/mL, aumentará el número de niños falsamente etiquetados como portadores de ITU. Sin embargo, esto es apropiado porque (1) el número los niños etiquetados falsamente como que tienen una ITU serán menos del número de niños con ITU omitidas que se descubrirán, y (2) las consecuencias negativas de omitir una ITU febril generalmente superan las de prescribir un curso adicional de agentes antimicrobianos.

En conclusión, utilizando la secuenciación 16S como referencia estándar, encontraron evidencia empírica preliminar que apoya el uso de un límite de 10 000 UFC/mL para el diagnóstico de ITU en niños pequeños con fiebre. 

Este estudio de precisión diagnóstica apoya el uso de un punto de corte de 10.000UFC/mL para diagnosticar infección del tracto urinario en niños febriles a los que se les realizó una cateterización vesical.

Se necesitan más estudios en diferentes entornos clínicos para para validar este nuevo punto de corte.

Resumen y comentario objetivo: Dra. Alejandra Coarasa