Introducción

La nitazoxanida es un antimicrobiano de amplio espectro con actividad contra distintos microorganismos. Si bien inicialmente se utilizó para el tratamiento de las infecciones intestinales por protozoarios, las propiedades antivirales de la nitazoxanida se descubrieron mientras se la empleaba para la terapia de la criptosporidiosis en los pacientes con sida. En la actualidad, este fármaco se encuentra en evaluación clínica para el tratamiento de la hepatitis C crónica, con resultados promisorios cuando se asocia con interferón pegilado, ya sea solo o en combinación con la ribavirina.

La nitazoxanida y su metabolito activo, la tizoxanida, inhiben la replicación de los genotipos 1a y 1b del virus de la hepatitis C. Ambas drogas tienen acción sinérgica con el interferón-alfa y con la 2’-C-metil-citidina (2CMC), e incluso son eficaces contra los replicones del virus, resistentes a la propia 2CMC y al telaprevir.

En este trabajo, los autores presentaron los resultados de la evaluación in vitro de la actividad de la nitazoxanida, la tizoxanida, el interferón-alfa, la ribavirina y la 2CMC sobre la replicación del virus de la hepatitis C en cultivos de líneas celulares. A tal fin, realizaron la transferencia del ARN completo de las células con replicones virales, sensibles o resistentes a la tizoxanida.

Materiales y métodos

Se transfirió ARN trascripto in vitro mediante el uso de un plásmido en cultivos de la línea celular Huh7, que fueron incubados en medios apropiados durante 3 semanas. Transcurrido este período se obtuvo una colonia resistente a la actividad del antibiótico G418, que fue aislada, expandida y sometida a múltiples pasajes por concentraciones crecientes del fármaco mencionado. Esta colonia fue denominada RP7.

A partir de algunas de las células del cultivo RP7, se indujo la resistencia a nitazoxanida y a tizoxanida mediante la exposición a dosis tituladas de ambos fármacos en los medios de cultivo. De este modo, se obtuvieron 2 líneas celulares nuevas, resistentes a una concentración de 11 µM de nitazoxanida y a 9 µM de tizoxanida, denominadas NTZ-11 y TIZ-9, respectivamente.

La actividad antiviral de cada una de las drogas evaluadas se midió a través del cálculo de las concentraciones eficaces (CE50 y CE90) por regresión linear. Del mismo modo, se estimó la CC50 (definida como la concentración del fármaco que produjo el 50% de reducción en la captación de colorante rojo neutro de los cultivos celulares no tratados).

Resultados

El nivel inicial de ARN viral fue similar en las 3 líneas celulares consideradas. Los cultivos de células con replicones virales resistentes a nitazoxanida y a tizoxanida tuvieron una reducción de 2 a 4 veces en la sensibilidad a los efectos citotóxicos de estas drogas, pero la disminución de los efectos antivirales fue de 7 a 34 veces mayor. La sensibilidad relativa de la replicación viral, tanto para la ribavirina como para la 2CMC, fue equivalente en las líneas RP7, NTZ-11 y TIZ-9. De todos modos, la potencia del interferón sobre la replicación del virus en las líneas celulares resistentes fue 3 a 8 veces superior a la obtenida sobre las células de la línea RP7.

Para probar la hipótesis de que la menor sensibilidad a la tizoxanida y la mayor sensibilidad al interferón eran el resultado de mutaciones genéticas inducidas en los replicones de las células de NTZ-11 y TIZ-9, los autores transfirieron el ARN de estas líneas a un cultivo de células Huh7.5 no expuesto a fármacos. No se observaron diferencias significativas en la sensibilidad de las colonias a la tizoxanida, al interferón o a la 2CMC. De esta manera, con la exposición a niveles de 100 IU/ml de interferón o 10 µM de tizoxanida se logró la inhibición completa de la formación de colonias, de manera independiente de la fuente de ARN utilizada. Del mismo modo, no se verificaron diferencias relevantes en el número relativo de colonias producido a partir del ARN, tanto de células resistentes como de las líneas celulares originales.

Discusión

Después del pasaje seriado de elementos de la línea celular RP7 en medios de cultivo que contenían nitazoxanida o tizoxanida, la sensibilidad relativa de las líneas celulares resultantes a los efectos citotóxicos y antivirales de estos fármacos disminuyó de manera sustancial. En cambio, la susceptibilidad de los replicones resistentes a la ribavirina y a la 2CMC no presentó modificaciones. De todas maneras, la replicación viral de estas líneas celulares resultó varias veces más sensible a las acciones del interferón-alfa en comparación con los cultivos iniciales.

Los investigadores afirman que este hallazgo es congruente con los resultados de algunos estudios anteriores, en los que el tratamiento previo de las líneas celulares con nitazoxanida potenció la actividad de una terapia subsiguiente con la asociación entre este fármaco e interferón. Asimismo, en otras publicaciones se mencionó que la tasa de respuesta viral parece aumentar cuando se administra nitazoxanida en forma previa o concomitante al uso de interferón pegilado, con ribavirina o sin ella. Los mecanismos de interacción entre la nitazoxanida y el interferón sobre la inhibición del virus de la hepatitis C se encuentran en fase de investigación.

Si bien se obtuvieron replicones con resistencia fenotípica a la nitazoxanida y a la tizoxanida mediante la exposición seriada de los cultivos celulares a concentraciones crecientes de estas drogas, los investigadores destacan que no lograron transferir esta resistencia a través de la transinfección por el ARN de las células afectadas. En consecuencia, proponen que la resistencia fenotípica se asocia con cambios no identificados en las células del huésped. La aparente ausencia de resistencia adquirida en el genoma del virus, expuesto tanto a la nitazoxanida como a la tizoxanida, contrasta con la rápida aparición de resistencia durante el tratamiento de la hepatitis C con otros fármacos en fase experimental, como los inhibidores de la proteasa NS3 o de la polimerasa NS5B. En el caso de estas drogas, la resistencia puede atribuirse a mutaciones específicas en el genoma viral que se transmiten por transinfección a las líneas celulares de células Huh7 no infectadas previamente por el virus de la hepatitis C.

Conclusiones

Los autores señalan que la nitazoxanida y la tizoxanida inhiben la replicación del virus de la hepatitis C por un mecanismo celular diferente al de las drogas que se emplean clásicamente, pero que es complementario al del interferón-alfa. Asimismo, aseguran que el uso de esta clase de fármacos para el tratamiento de la hepatitis C crónica puede resultar promisorio para permitir el avance de las investigaciones clínicas.