Test del ADN fecal para la detección del cáncer colorrectal

En EE. UU., el cáncer colorrectal (CCR) ocupa el tercer lugar en incidencia global y el segundo en incidencia de muerte por causa en ambos sexos. A partir de 2019, el cribado de la población con riesgo medio de CCR ha ayudado a reducir la incidencia y las muertes posteriores, con la aplicación de pruebas de detección que muestran durabilidad para la prevención del CCR con el tiempo.

Varias sociedades médicas recomiendan la aplicación de una de varias estrategias de detección de CCR para continuar reduciendo la incidencia en personas con riesgo promedio. Estas incluyen pruebas de primer nivel como la colonoscopía y test inmunoquímico fecal (TIF); pruebas de segundo nivel, como colonografía por tomografía computarizada; pruebas de ADN fecal (ADNf) y sigmoidoscopia flexible; y, pruebas de tercer nivel como la cápsula endoscópica.

Otras pruebas de detección del CCR, como la prueba de sangre oculta fecal (SOMF) y el enema de bario, se han vuelto relativamente obsoletas debido a la mayor sensibilidad y especificidad de las pruebas de primer y segundo nivel. Las pruebas de ADNf han llegado recientemente al mercado comercial después de múltiples generaciones y prototipos.

En estudios de casos y controles, cada generación de pruebas de ADNf mejoró con respecto a las anteriores, en términos de sensibilidad, producto de las innovaciones técnicas que afectan la preservación de las muestras, paneles de biomarcadores objetivo discriminantes mejorados y plataformas analíticas mejoradas. De 6 versiones de pruebas de ADNf total desarrolladas, 2 alcanzaron el estado de prueba de laboratorio diagnóstica regulada por Clinical Laboratories Improvement Act (Ley de Mejora de Laboratorios Clínicos), antes de la última versión, que recibió la aprobación de la FDA en 2014.

Actualmente, las pruebas de ADNf se consideran de segundo nivel para la detección del CCR debido a su sensibilidad para la detección de pólipos adenomatosos, así como su costo, particularmente en comparación con la relación riesgo-beneficio de la colonoscopia y el TIF. Las mejoras continuas en las nuevas generaciones pueden aumentar la sensibilidad y/o permitir una reducción de los costos, lo que en el futuro hará que como cribado de primer nivel se recomienden las pruebas de ADNf. La prueba comercial actual de ADNf aprobada por la FDA es útil para pacientes que pueden rechazar o sentirse incómodos con la colonoscopia, cuando la colonoscopia es de alto riesgo debido a morbilidad médica, o si la colonoscopia no está disponible. El ADNf tiene mayor sensibilidad que el TIF. Con estudios adicionales, podría ocupar nichos de utilidad para la detección y el seguimiento durante los intervalos del cribado o cuando la colonoscopia es negativa.

El CCR es una enfermedad genética. El microambiente colónico local influye en la composición genética de los colonocitos que están preparados (por ej., que ya contienen una alteración genética o epigenética de la línea germinal) o inducidos somáticamente (que causa alteraciones genéticas y epigenéticas somáticas posteriores) a formar neoplasias.

Los CCR esporádicos resultan de la acumulación de genes somáticos y eventos epigenéticos a través de la expansión celular clonal. Cada clon puede adquirir mutaciones genéticas adicionales (también conocidas como mutaciones impulsoras) que pueden conferir una ventaja de crecimiento selectivo, impulsando además hacia las neoplasias malignas.

Si bien el CCR de cada paciente es genéticamente único, la mayoría de los CCR esporádicos tienen varios eventos mutacionales comunes que se han acumulado desde el inicio. Alrededor del 85% de los cánceres esporádicos son aneuploides y contienen mutaciones frecuentes de APC, TP53, KRAS, TTN, PIK3CA, FBXW7 y SMAD4. Alrededor del 15% de los cánceres esporádicos son diploides pero hipermutados, acumulando cientos de mutaciones somáticas que son impulsadas por la hipermetilación del gen MLH1 de reparación de errores de coincidencia del ADN (MNR). La hipermetilación previene la transcripción y posterior expresión proteica de MLH1 y, por lo tanto, inactiva el completamente al MMR.

Debido a los errores de replicación del ADN después de la reparación ADN MMR (sustituciones de un solo nucleótido y deslizamientos de secuencia de microsatélites), esta inactivación permite que se acumulen múltiples mutaciones en el genoma celular. Por otra parte, este grupo hipermutado de CCR muestra un complemento diferente de genes mutados somáticamente (ACVR2, APC, TGFBR2, BRAF, MSH3, MSH6 y otros), en gran parte debido a cambios de marco de lectura del código de codificación microsatélite intrínseco.

En cualquier grupo genético, los clones derivados de las células parentales pueden adquirir mutaciones conductoras y pasajeras adicionales (es decir, mutaciones que no proporcionan una ventaja de crecimiento selectivo) a diferentes ritmos, lo que hace que la neoplasia crezca heterogénea. Esto ha sido observado mediante muestreo directo de CCR mediante la colonoscopia o después de la resección quirúrgica, así como de metástasis de CCR. La metilación epigenética de los promotores de genes también se adquiere durante la patogénesis del CCR. Además de que algunos 2 CCR adquieren hipermetilación MLH1, otros genes como SFRP, vimentina, MGMT, FBN1 y p16 pueden estar metilados de manera característica.

El avance del conocimiento en la genética de la patogénesis del CCR informaría cuáles serían los enfoques para posibles pruebas no invasivas si se pudiera tomar muestras de una posible neoplasia como biomarcadores definitivos del estado neoplásico, sin un procedimiento invasivo y detectar la presencia de alteraciones genéticas como las indicadas anteriormente.

La materia fecal expulsada se formó en el colon y tuvo el mayor tiempo de permanencia allí, y por lo tanto representa muy bien los contenidos del colon. Las células apoptóticas normales se exfolian hacia la luz del colon y las células neoplásicas con ADN alterado proliferan a un ritmo más rápido. También se eliminan a un ritmo más rápido hacia la luz debido a que tienen menor adhesión a la membrana basal. La abrasión fecal de las lesiones neoplásicas puede facilitar aún más la entrada de células en la luz, tanto para los CCR como para los pólipos adenomatosos precursores.

El ADN humano constituye sólo el 0,01% del ADNf total y debe ser separado del ADN microbiano en las heces, mucho más abundante. El ADN mutante humano está aún en menor proporción en las heces, y es necesario evaluar su integridad para garantizar la capacidad de detectar alteraciones genéticas. Sin embargo, es más probable que el ADNf tumoral permanezca intacto que el ADN normal una vez que se haya derramado. Los avances tecnológicos en la preservación de muestras para prevenir la degradación del ADNf y las plataformas analíticas más nuevas que ofrecen mayor sensibilidad han hecho que las pruebas de ADNf sean fácilmente factibles.

Con el avance del conocimiento del panorama del genoma mutacional del CCR, los enfoques para detectar el ADNf se iniciaron como una posible prueba no invasiva para la detección del CCR.

La mayoría de las evaluaciones del ADNf fueron estudios de casos y controles para el desarrollo de pruebas o la validación inicial. El último estudio de ADNf se centró en la detección de KRAS mutante debido a sus mutaciones predecibles en los codones 12, 13 y 61. Sin embargo, se esperaría que las pruebas de un solo gen, como el KRAS mutante, dieran algunos resultados positivos falsos (el KRAS mutante está presente en otras afecciones benignas y malignas fuera del colon), así como tan baja sensibilidad como prueba única (KRAS mutante está presente solo alrededor del 50% de los CCR).

Múltiples genes y/u objetivos múltiples analizados basándose en el conocimiento de la progresión neoplásica del CCR brindaron la oportunidad de mejorar la precisión de la detección de neoplasias colónicas. El APC mutante y TP53, aunque son comunes en la patogénesis del CCR, son más difíciles de detectar con una prueba porque sus mutaciones se distribuyen a lo largo de cada gen. Más recientemente, el descubrimiento de anomalías de la metilación de promotores de genes específicos ha hecho que los genes hipermetilados sean mejores objetivos para los ensayos de ADNf especialmente porque la metilación anormal es un evento temprano en la tumorogénesis del CCR.

Después de múltiples y heterogéneos estudios de prueba de concepto y de casos y controles, solo 4 estudios transversales basados en la población examinaron el rendimiento del ADNf durante el uso de la colonoscopia como estándar de oro para la detección. Antes de la prueba de ADNf de última generación se utilizó un prototipo de prueba de ADN de 21 objetivos (incluyendo ensayos para KRAS mutante, APC y el marcador microsatélite mononucleótido BAT26 y, ensayos de integridad del ADN) en una muestra única de heces, para comparar con el test de SOMF. Este estudio, que examinó a 2.507 personas asintomáticas >50 años comprobó una tasa de sensibilidad del CCR del 51,6% para el ADNf y de 12,9% para la prueba de SOMF, y una tasa de sensibilidad de los adenomas avanzados del 15,5% para el ADNf y del 10,6% para el test de SOMF.

En general, el ADNf detectó el 40,8 % de los CCR/adenomas avanzados, mientras que en este estudio, el test de SOMF detectó al 14,1%. La especificidad del ADNf fue del 94,4%, similar a la especificidad del test de SOMF (95,2%). Un estudio realizado en paralelo utilizando el mismo ensayo de 21 objetivos en 4.482 personas de riesgo promedio mostró una sensibilidad del ADN CCR del 25% y una especificidad del 96%. Aunque esta prueba de ADNf detectó más adenomas avanzados y CCR que el test de SOMF, en estos 2 estudios poblacionales, ambos ADN y las pruebas de SOMF omitieron la mayoría de las lesiones detectadas en la colonoscopia.

Los resultados decepcionantes de los estudios poblacionales de ADNf de generaciones anteriores fueron en gran medida mejorados con el uso de tecnologías optimizadas y nuevos ADN objetivos dando lugar a las pruebas de última generación. Estas mejoras finalmente llevaron a su aprobación de la FDA y a una formulación prescriptiva más aceptable.

La prueba de ADNf de última generación es una herramienta de ADNf multiobjetivo optimizada (ADNmt) que incluye ensayos para KRAS mutante, metilación aberrante de BMP3, NDGR4 y β-actina como gen de referencia para la estimación cuantitativa de la cantidad total de ADN humano en la muestra. Estos objetivos obtenidos de muestras fecales se someten a un examen de ADNf multidiana multiplexado QuARTSTM (amplificación de señal y objetivo en tiempo real cuantitativo, específico de alelo). Esta prueba de ADNmt de última generación también incluye un análisis de hemoglobina humana (es decir, TIF).

La evaluación inicial de esta prueba de ADNmt se realizó en muestras de heces archivadas de 252 pacientes con CCR, 293 controles negativos en la colonoscopia y 133 pacientes con adenomas de al menos 1 cm de diámetro. Este estudio demostró una sensibilidad para el CCR del 85% (especificidad del 90%) y una sensibilidad para los adenomas avanzados del 54% (especificidad 89%).

El estudio no detectó diferencias en la sensibilidad para la ubicación de los adenomas o los cánceres, lo que implica que tomó muestras de todo el colon sin discriminación del sitio. Como resultado del estudio piloto se realizó un estudio poblacional transversal fundamental que utilizó una medida cuantitativa para cada marcador. Estas medidas se introdujeron en una ecuación de regresión logística validada con >182 positivos y >100 ng de Hb/ml, considerado positiva para el TIF. Este estudio de 9.989 personas asintomáticas de 50 a 84 años comparó la prueba única con ADNmt vs. TIF, utilizando la colonoscopia como método de oro estándar.

La tasa de sensibilidad para el CCR (todas las etapas) fue del 92,3% para la prueba de ADNmt y 73,8% para el TIF (con especificidades del 86,6% y 94,9%, respectivamente). En el caso de los adenomas avanzados, la tasa de sensibilidad fue del 42,4% para la prueba de ADNmt y del 23,8% para el TIF. Para los adenomas serrados (un adenoma de mayor riesgo), la sensibilidad fue del 42,4% para la prueba de ADNmt y del 5,1% para el TIF.

En general, la prueba de ADNmt detectó adenomas y CCR más avanzados que el TIF, pero tuvo más resultados positivos falsos. Un segundo estudio transversal realizado en 661 nativos de Alaska (que tienen altas tasas de CCR) utilizando la prueba de ADNmt mostró resultados similares. Las sensibilidades de los CCR para pacientes de raza blanca, raza negra, hispanos y asiáticos fueron 96,4%, 62,5%, 88,9% y 100%, respectivamente, mientras que la sensibilidad de los adenomas avanzados fueron 42,3%, 42,4%, 39,0% y 43,8%, respectivamente.

La FDA aprobó la prueba ADNmt en agosto de 2014 para la detección en personas ≥50 años con riesgo promedio de CCR. Los pacientes reciben un kit que contiene un recipiente colector en la que pueden evacuar las heces mientras están sentados en el inodoro de su casa.

Una porción de la materia fecal se raspa para el TIF y se coloca en un tubo, mientras que al resto se le añade un líquido preservante del ADN de la materia fecal en el recipiente, para su posterior análisis molecular. Tanto el tubo como el recipiente son enviados por el paciente al laboratorio, en una caja, para su procesamiento y análisis dentro de las 72 h de la recolección, con el consiguiente informe enviado al paciente.

No se conocen sustancias de interferencia para esta prueba y no requiere preparación intestinal. El informe generado vuelve como positivo o negativo; pero un informe positivo no diferencia cuál de los componentes (análisis molecular o TIF) fue el positivo.

Una encuesta de 434 hombres y mujeres sobre una potencial prueba de detección de múltiples cánceres mediante una prueba de ADNf multiorgánico calificada mostró las características más atractivas para los encuestados: ausencia de preparación intestinal, seguridad, no invasividad. También hubo una mayor preferencia por las pruebas de ADNf multiorgánico sobre la prueba de ADNmt solo del colon y recto, que a su vez tuvo preferencia sobre el test de SOMF, la colonoscopia, la sigmoidoscopia y el enema de bario (en ese orden).